近年来，随着碳青霉烯抗生素的广泛应用，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)呈现出全球蔓延趋势，已成为国内外共同面临的严峻挑战^[1]。2013年美国疾病控制与预防中心(CDC)将耐碳青霉烯酶类肠杆菌目细菌列为最高级别“紧迫威胁”。全国细菌耐药监测网(China Antimicrobial Resistance Surveillance System, CARSS)报告^[2]结果显示，我国CRKP检出率由2014年的6.4%上升至2019年的10.9%，湖北省从4.4%上升至12.4%，上升速度较快。研究^[3-5]表明，碳青霉烯酶敏感肺炎克雷伯菌感染致死率为20%~30%，而CRKP感染致死率为40%~70%，其直接后果是影响抗菌药物治疗效果，缩短新药应用与研发周期，延长患者治疗周期和增加患者治疗成本。消毒是切断传播途径，阻断CRKP传播的重要措施之一，随着各种消毒剂的广泛使用甚至滥用，菌株选择压力加大，细菌对消毒剂的耐药现象逐渐显现，目前常采用耐消毒剂基因检出率判断细菌对消毒剂的耐受性。消毒剂抗性增加与耐消毒剂基因相关。qacEΔ1编码的外排系统广泛存在于革兰阴性菌中，检出率与菌株对消毒剂敏感性下降呈现相关性^[6]。肺炎克雷伯菌中cepA外排泵与对氯己定的敏感性降低有关^[7]，随着氯己定最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)的增加，肺炎克雷伯菌cepA的表达也增加^[8]，且CRKP中携带耐消毒剂基因种类存在较大的地区差异性^{[7, 9-10]}。武汉地区缺乏相关的系统研究，为了解本地区不同医院CRKP中耐药消毒剂基因携带情况及同源性，为预防和控制其克隆传播提供理论依据。本项目采用多中心研究，收集武汉地区3所医院从临床住院患者分离的CRKP菌株，采用MIC测定法进行药敏试验，采用实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR, RT-PCR)检测耐消毒剂的qacEΔ1和cepA基因携带情况，采用脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)对同时携带qacEΔ1和cepA基因的CRKP菌株进行同源性分析。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 菌株来源

收集2018—2019年来自湖北省妇幼保健院(代码Ⅰ)、武汉市第一医院(代码Ⅱ)和黄陂区人民医院(代码Ⅲ)3所三级医院从临床住院患者分离的62株非重复性CRKP。菌株入选标准: (1)为CRKP，即肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南或厄他培南其中的任何一种耐药(亚胺培南或美罗培南MIC≥4 μg/mL，厄他培南MIC≥2 μg/mL)；(2)少数患者住院期间多次培养出CRKP，则纳入该患者首次培养的CRKP。3所医院按照要求保存符合纳入标准的CRKP菌株，由研究者单位每两个月收集一次，集中保存于-80℃医用冰箱中。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，沙门氏菌H9812，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心。本研究通过武汉市疾病预防控制中心伦理委员会批准(WHCDCIRB-K-2021038)。

1.2 主要仪器与试剂

全自动细菌鉴定及药敏分析系统(法国生物梅里埃公司，VITEK 2 Compact)、荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司，LightCycler 480)、脉冲场凝胶电泳仪(美国Bio-Rad公司，CHEF Mapper XA)、凝胶成像系统(美国UVP公司，ESSENTIAL V6)、细菌DNA提取试剂盒(北京康为世纪公司)、PCR反应试剂盒(日本Takara公司)、PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.3 菌株复核与药敏试验

采用全自动细菌鉴定及药敏分析系统对CRKP菌株进行复核鉴定及药敏试验，检测18种抗菌药物的MIC，包括亚胺培南、美罗培南、厄他培南、氨苄西林、哌拉西林、阿莫西林/克拉维酸、头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、头孢吡肟、氨曲南、阿米卡星、庆大霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因、复方磺胺甲唑和四环素。药敏试验质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922，药敏试验结果判定依据美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standard Institute, CLSI)2018年版标准进行。

1.4 耐消毒剂基因检测

采用RT-PCR扩增CRKP中耐消毒剂的qacEΔ1、cepA基因，根据GenBank数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中基因序列(qacEΔ1：DQ489717.1，cepA: AB073019.1)，利用Primer Premier 5软件合理设计qacEΔ1、cepA基因引物，见表 1。参照细菌DNA提取试剂盒说明书提取DNA，设定PCR反应条件，PCR反应体系共20 μL，包括PCR反应试剂mix 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，探针0.4 μL，DNA模板1 μL，加双蒸H₂O补足体积。扩增条件为94℃，10 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 1 s，40个循环。通过荧光扩增曲线观察结果。

1.5 同源性分析

采用PFGE对同时携带qacEΔ1和cepA耐消毒剂基因的CRKP菌株进行同源性分析。参考中国疾病预防控制中心Pulse Net提供的PFGE相关标准化操作程序，调整相关电泳参数。试验方法：菌株包埋入胶块后，经裂解和清洗，使用限制性内切酶XbaI进行酶切，酶切后的胶块置入0.5×TBE缓冲液和1%凝胶中电泳。电泳参数为电压6 V/cm，夹角120度，温度14℃，初始脉冲为6 s，最终脉冲为36 s，电泳时间18.5 h。电泳结束后，在凝胶成像仪上读取图像。

1.6 数据分析

应用WHONET 5.6和SPSS 25.0软件进行数据分析。采用BioNumerics 7.6软件对PFGE条带进行聚类分析，用非加权配对算术平均法(unweighted pair group average method, UPGAM)和Dice系数分析菌株间的同源性，将具有80%以上相同条带的菌株归入同一型别^[11]。

2 结果 2.1 基本情况

62株CRKP来源于3所医院13个不同的临床科室，主要分布在重症监护病房(ICU)，占77.42%，其中综合ICU、儿科ICU(PICU)、神经内科ICU(NICU)分别占43.55%、22.58%、11.29%。按照年龄分组，老年人(≥65岁)组占比最高，为48.39%，其次为儿童(＜14岁)组和成人(14~65岁)组，分别占30.64%、20.97%。62株CRKP主要来源于痰(占40.32%)，其次为尿标本(占16.13%)。见表 2。

2.2 药敏试验结果

62株CRKP均为多重耐药菌，对阿莫西林/克拉维酸、头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松和厄他培南5种抗生素的耐药率均为100%，对四环素的耐药率最低(为35.48%)，对临床其他常见抗菌药物也呈现高度耐药，耐药率为59.68%~98.39%。见表 3。

2.3 耐消毒剂基因检出情况

62株CRKP，59株(95.16%)检出耐消毒剂基因，其中40株(64.52%)qacEΔ1基因阳性，57株(91.94%)cepA基因阳性，38株(61.29%)同时检出qacEΔ1和cepA基因。

2.4 同源性分析

PFGE结果显示，38株同时检出qacEΔ1和cepA的CRKP可分为A~K共11个型别。其中5个型别包含菌株数＞1株，以E型为主，占42.11%(16株)，分布在2所医院的5个科室；C型占15.79%(6株)，分布在1所医院的3个科室；I型占10.53%(4株)，分布于同一医院的同一科室；H型和K型，均占7.89%(各3株)，分布于同一医院的不同科室。见图 1。

3 讨论

本研究收集来自武汉地区3所三级医院临床住院患者分离的62株CRKP，首次分析本地区CRKP耐消毒剂基因的携带情况及耐消毒剂基因阳性菌株的同源性，是对国内CRKP菌株多中心分子流行病学研究的有力补充。该研究收集的CRKP，主要来源于ICU，包括综合ICU和专科ICU，占77.42%，可能与ICU患者大多数免疫力低下、基础性疾病较多、住院时间长、插管或机械通气等侵入性操作较多有关。应重点加强ICU抗菌药物应用的管理及医院感染防控工作。62株CRKP，40.32%来源于痰标本，可能与人体的呼吸道与外界相通，自身免疫屏障作用较弱，再加上空气污染等因素相关，病原体更容易入侵定植，从而引起呼吸系统感染，提示临床医生应重点加强患者的气道管理。

本研究显示，所有CRKP均为多重耐药菌，对厄他培南的耐药率达100%，对美罗培南、亚胺培南的耐药率分别为96.77%、98.39%，对青霉素类、β-内酰胺类/β-内酰胺抑制剂复合物、头孢菌素类、单环内酰胺类和喹诺酮类等多种抗菌药物表现出高水平耐药，仅对四环素的耐药率低于40%，说明武汉地区CRKP耐药形势十分严峻，与北京^[12]、广东^[13]、江西^[14]等地情况一致，应加强细菌耐药监测，在抗菌药物使用前进行病原学送检及药敏试验，为临床合理用药提供参考。

目前研究显示，肺炎克雷伯菌对各种消毒剂的耐受程度存在差异。李祥等^[15]研究报道，部分CRKP已对“84”消毒剂产生了轻度的抗性，耐消毒剂基因qacEΔ1-sul1与“84”消毒剂的抗性之间存在一定的相关性。qacEΔ1基因广泛存在于革兰阴性菌中，由整合子介导，与消毒剂的低水平耐药有关。Abuzaid等^[8]研究报道，87.5%的肺炎克雷伯菌分离株携带cepA基因；Chen等^[16]研究报道2016—2018年一所国内三级医院的36株CRKP，qacEΔ1阳性率为41.7%，cepA阳性率为80.6%；雷新云等^[17]报道，肺炎克雷伯菌中qacEΔ1检出率为62.50%。而在伊朗的一项研究^[10]报道，肺炎克雷伯菌中qacEΔ1和cepA基因检出率仅分别为30.6%、22.4%。本研究显示61.29%的CRKP同时携带qacEΔ1和cepA基因，其中qacEΔ1和cepA基因检出率分别为64.52%、91.94%，cepA基因检出率远高于qacEΔ1，提示qacEΔ1和cepA基因在医疗机构分离的CRKP中广泛存在，且携带cepA基因情况比携带qacEΔ1更为普遍。以上结果说明武汉地区CRKP菌株广泛携带qacEΔ1和cepA耐消毒剂基因，因此，应加强本地区耐消毒剂基因的监测，建立消毒剂耐药性监测网，定期监测和报告耐药情况，以期指导医疗机构科学选择消毒剂。

根据《医院感染暴发控制指南》(WS/T 524—2016)^[18]规定，医院感染暴发是指在医疗机构或其科室的患者中，短时间内发生3例以上同种同源感染病例的现象。在实际工作中，由于大多数医疗机构缺乏分子生物学监测技术手段，很难确认“同种同源”，可能导致出现耐药菌株的流行或暴发。PFGE分型技术是分子分型中最常采用的方法，具有分辨力高、重复性好的特点，被认为是暴发感染溯源中分型的“金标准”^[11]。本研究采用PFGE对38株同时携带qacEΔ1和cepA基因的CRKP进行同源性分析，结果显示，38株CRKP可分为A~K共11个型，以E型为主(42.11%)，主要分布于2所医院的5个科室，一所医院的ICU和康复科，另一所医院的ICU、NICU和急诊科，表明CRKP菌株存在跨医院水平克隆传播的可能。另外，C型、H型、K型主要分布在同一所医院的几个科室，提示CRKP菌株在3所医院均存在不同科室间的克隆传播。I型分布在一所医院的同一科室，进一步分析发现，此4例患者于2018年11月5—22日在PICU住院，1例患者因重症肺炎于11月5日最早入住PICU，其余3例患者因脓毒症、惊厥等疾病，分别于11月10日、15日、22日陆续入住该科室，结果提示CRKP存在同一科室内不同患者间的克隆传播，说明该院PICU可能存在CRKP医院感染暴发。当医疗机构内出现CRKP菌株后，如果缺乏及时有效的消毒措施，易于发生CRKP感染暴发流行。因此，当医疗机构出现感染性病例，尤其是疑似医院感染暴发时，应提高警惕，及时收集菌株，采用PFGE等分子流行病学方法快速查明感染源，有助于从切断感染途径方面入手，控制多重耐药菌的传播^[19]。

综上所述，武汉地区CRKP耐药形势严峻，广泛携带耐消毒剂基因，存在不同医院、不同科室间的克隆传播，应采取有效的消毒隔离措施，科学使用消毒剂，切断传播途径，从而有效控制医院感染的发生。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。