近年来，全球范围内肠杆菌科细菌尤其是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素的耐药率迅速升高，2013年美国疾病控制与预防中心(CDC)将耐碳青霉烯类肠杆菌(CRE)列为最高级别“紧迫威胁”^[1]。2014年世界卫生组织(WHO)发布的首份全球114个国家抗菌药物耐药监测报告显示，全球所有地区均已出现耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)，且有些国家超半数CRKP感染治疗无效^[2]。2017年中国CHINET细菌耐药监测报告显示, 肺炎克雷伯菌对美罗培南的耐药率高达23.1%，对亚胺培南的耐药率高达20%^[3]。CRKP感染的治疗是目前临床上亟待解决的医学难题，因此，本研究分析CRKP的流行特点及耐药机制，以期为临床CRKP感染的治疗提供实验室依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源

收集2017年1月—2018年6月某医院微生物室分离的对厄他培南或亚胺培南耐药的肺炎克雷伯菌，保存至-80℃冰箱，剔除同一患者同一部位分离的重复菌株。采用VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪及鉴定卡对肺炎克雷伯菌进行鉴定及药敏分析。药敏试验质控菌株：大肠埃希菌ATCC 25922，铜绿假单胞菌ATCC 27853。

1.1.2 仪器与试剂

抗菌药物标准品购自中国食品药品鉴定研究院，中国蓝琼脂平板、M-H琼脂平板购自上海哈灵生物科技有限公司，VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定仪、细菌药敏鉴定卡，麦氏比浊仪购自法国生物梅里埃生物有限公司，SanTaq PCR Mix预混液、基因扩增引物购自上海生工生物工程技术有限公司，琼脂糖分子量Marker DL2000、10×Loading buffer购自TaKaRa生物工程有限公司，全自动凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法 1.2.1 药敏试验

采用ATB半自动微生物分析仪进行药物敏感试验(MIC法)，仪器药敏结果有疑问或无法检测时用K-B纸片法进行检测。检测的抗菌药物包括氨曲南、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢他啶、头孢曲松、头孢替坦、头孢吡肟、厄他培南、亚胺培南、环丙沙星、左氧氟沙星、妥布霉素、庆大霉素、阿米卡星、呋喃妥因、复方磺胺甲唑、替加环素。替加环素药敏结果判定根据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会(EUCAST)标准进行判读，其余抗菌药物结果判定根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)2017年推荐的标准执行。多重耐药(multi drug resistance，MDR)指对在抗菌谱范围内的3类或3类以上抗菌药物不敏感(包括耐药和中介)；泛耐药(extensive drug resistance，XDR)指对除1~2类抗菌药物(主要指多粘菌素类和替加环素)外，几乎对所有类别抗菌药物不敏感；全耐药(pan-drug resistance，PDR)指对目前临床应用的所有类别抗菌药物均不敏感。

1.2.2 耐药基因检测

采用聚合酶链式反应(poly- merase chain reaction，PCR)扩增以下碳青霉烯酶基因：blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaSIM-1、blaSPM、blaGIM及blaNDM-1；OXA基因：blaOXA-48；超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum beta-lactamases, ESBLs)基因：blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaCTX-M-2、blaCTX-M-8、blaSHV与blaTEM。采用煮沸法提取细菌DNA，PCR扩增引物序列参照文献[4]合成，扩增产物使用1%琼脂糖凝胶电泳，采用全自动凝胶成像分析系统观察PCR扩增产物结果，阳性扩增产物送北京华大基因研究中心进行测序，然后将测序结果与GenBank中BLAST序列进行比对。

2 结果 2.1 CRKP感染患者临床特点

2017年1月—2018年6月共收集57株CRKP，57例感染患者，其中男性30例，女性27例；年龄(73±14)岁；住院时间(81±127)d；大部分患者合并有基础疾病，主要包括高血压(32例)、糖尿病(13例)、心功能不全(30例)、肾功能不全(10例)、恶性肿瘤(3例)；APACHE评分为(11.96±5.26)分。

2.2 CRKP标本来源及病区分布情况

57株CRKP主要来源于呼吸道标本，分别为痰(34株，59.65%)、肺泡灌洗液(11株，19.30%)、咽拭子(1株，1.75%)；其次为尿(6株，10.53%)，血(2株，3.51%)，脑脊液、脓液和胆汁(各1株，各占1.75%)。来源科室主要为神经内科(20株，35.09%)、呼吸内科(15株，26.32%)、重症医学科(9株，15.79%)，其次为神经外科(5株，8.77%)、康复医学科(3株，5.26%)、肾内科(2株，3.51%)，心内科、艾滋病科、内分泌科各1株(各占1.75%)。

2.3 CRKP药敏试验结果

药敏结果显示，复方磺胺甲唑耐药率最低(15.79%)，其次为替加环素(50.88%)、阿米卡星(57.89%)、庆大霉素(75.44%)、妥布霉素(78.95%)、左氧氟沙星(94.74%)、哌拉西林/他唑巴坦(96.49%)、环丙沙星(96.49%)、呋喃妥因(98.25%)，CRKP菌株对其余8种抗菌药物的耐药率均为100%，见表 1。其中MDR菌株53株(92.98%)，XDR菌株2株(3.51%)，PDR菌株1株(1.75%)。神经内科分离的MDR菌最多(17株)，见表 2。

2.4 耐药基因检测结果

57株CRKP共检出2种碳青霉烯酶基因(KPC-2、NDM-1)，4种ESBLs基因(SHV、CTX-M-9、TEM、CTX-M-1)，部分PCR扩增产物见图 1、2。57株CRKP中，1株检出NDM-1基因；39株KPC-2阳性，阳性率为68.42%，其中21株同时携带SHV、CTX-M-9和TEM基因，8株同时携带SHV基因，6株同时携带SHV和CTX-M-9基因，4株同时携带SHV和TEM基因。57株菌株全部检出ESBLs基因，见表 3。将1号和8号菌株扩增的PCR产物进行测序，测序后结果与BLAST中序列编号LR130548.1进行比对，一致性为99.22%。

2.5 不同耐药基因阳性株与阴性株药敏结果比较

blaKPC基因、CTX-M-9及TEM基因阳性株与阴性株对氨曲南、氨苄西林/舒巴坦、厄他培南、头孢曲松、头孢他啶、头孢替坦、头孢吡肟、头孢唑林、亚胺培南的耐药率均无差异，均为100%，3个基因阳性株和阴性菌对其他常用抗菌药物的耐药率均相近，见表 4。

3 讨论

目前，国内外CRKP的药敏试验结果显示，CRKP对多粘菌素、复方磺胺甲唑、替加环素和阿米卡星仍有一定敏感性^[5-8]。北京大学人民医院牵头进行的一项中国大规模CRE纵向研究，共收集1 201株CRKP，这些菌株对多粘菌素、替加环素、米诺环素的耐药率相对较低，分别为1.4%、3.1%、31.1%；对阿米卡星、磷霉素、氯霉素有一定的敏感性，耐药率分别为57.5%、69.6%、70.3%；对喹诺酮类的耐药率在80%以上^[5]。然而，Dong等^[6]报道CRKP对阿米卡星的耐药率较低，仅为5.8%，环丙沙星为15.4%，且此研究中所检菌株对多粘菌素均敏感。另外我国黑龙江省某三甲医院的研究^[7]显示，CRE对阿米卡星和左氧氟沙星的耐药率也低于30%。一项全国范围内CRE的流行病学调查报告^[9]显示，替加环素对CRKP的敏感率仅为40.2%。

本研究收集的CRKP对阿米卡星、替加环素有一定的敏感性，但对替加环素的耐药率达50.88%，可能与近年来替加环素使用增加，耐药率随之增加有关^[10]。Dong等^[6]报道所检CRKP对阿米卡星和喹诺酮类药物的耐药率低。但本研究CRKP对左氧氟沙星的耐药率达97%，对阿米卡星的耐药率为57.89%，可能与Dong等^[6]研究收集的菌株来自儿童医院，儿童很少使用此类药物有关。

本组CRKP对复方磺胺甲唑耐药率较低，与报道^[11]相似。Su等^[12]研究复方磺胺甲唑联合方案对CRKP的体外抗菌活性检测发现，复方磺胺甲唑联合多粘菌素能在2~24 h内快速杀灭CRKP，该方案有希望用于临床治疗CRKP感染。但由于复方磺胺甲唑为抑菌剂，目前仅有口服制剂，且Su等^[12]研究仅为体外研究，缺乏临床治疗CRKP的循证医学证据，其治疗CRKP感染的地位仍不明确，有待进一步的临床研究证实。

近年来，CRKP的耐药机制受到广泛的关注。目前研究结果显示，其主要耐药机制包括：(1)产碳青霉烯酶，包括以产KPC酶为主的A类碳青霉烯酶和以锌离子为活性中心的B类金属β-内酰胺酶和D类的OXA-48; (2)高产AmpC酶或ESBLs合并外膜蛋白的丢失; (3)外排泵的高表达; (4)结合位点缺失、数量下降或亲和性降低等^[13-16]。本研究共检测了包含碳青霉烯酶基因及ESBLs基因在内的14种耐药基因。

57株CRKP均检出ESBLs基因, 仅1株检出NDM-1，未检出IMP及VIM。我国ESBLs流行的种类主要为CTX型和SHV型^[17]，本研究收集的CRKP菌株中，SHV型占96.49%(55/57)，CTX型占71.93%(41/57)。

本研究检测出的碳青霉烯酶耐药基因主要为KPC基因，检出率为68.42%，KPC-2是导致该院CRKP对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。KPC酶于2004年在我国浙江省首次被发现^[18]，随后全国多个地区相继有产KPC-2酶CRKP流行的报道^[19-21]。有报道^[22]指出，产KPC-2是中国华东地区肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的重要原因。不同国家CRKP携带的碳青霉烯酶耐药基因差异较大，我国肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶的常见基因类型为KPC-2，少有NDM-1，偶有金属酶IMP、VIM、SIM及OXA-48检出；而印度以NDM为主，西班牙以VIM为主^[22]。在我国不同地区，CRKP携带的碳青霉烯酶耐药基因分布也有一定差异，KPC-2是我国肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要基因类型，其中福建、河南、河北、蒙古KPC-2的检出率达100%，北京、广东、山东地区接近70%。有一项研究显示湖南地区的耐药基因主要为NDM-1(4/5, 80%)，推测可能与该项研究中湖南地区检测菌株数量少相关^[9]。

本研究存在不足之处，首先由于检测仪器为半自动微生物分析仪，药敏试验并未涵盖所有推荐的治疗药物，如多粘菌素、磷霉素以及新上市的头孢他啶/阿维巴坦^[23]，以致药敏试验数据不充分，对临床治疗的参考价值受到一定的限制。另外，本研究只检测了部分有代表性的耐药基因，对于其他少见的基因如KPC-12、NDM-5并未进行检测，且未进行同源性分析，可以在后续研究中对CRKP的耐药及传播机制进行更加深入地研究。

总体而言，本研究对CRKP的临床分布、药敏试验及耐药基因进行了分析，但具体的传播机制及临床治疗方案需待进一步研究。面对CRKP感染的挑战，临床医务人员应加强医院感染防控意识，合理使用抗菌药物，控制CRKP播散流行。

致谢: 诚挚地感谢中南大学湘雅三医院及长沙市第一医院微生物室的老师对本次研究工作提供的支持!