铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)是引起医院感染的主要条件致病菌^[1]。随着抗菌药物的广泛使用，PA耐药情况越来越严重，常常出现多重耐药和泛耐药PA，导致严重且难以治疗的医院获得性感染^[2]。免疫力低下患者对PA具有较高的易感性，PA引发的感染在该类人群中可导致较高的病死率^[3]。

异质性耐药(heteroresistance, HR)现象在1947年首次被发现于革兰阴性细菌流感嗜血杆菌^[4]中，20年后在革兰阳性细菌葡萄球菌中再次被观察到，但直至1970年“异质性耐药”的概念才明确被提出。临床上常根据微生物自动化检测仪的药敏结果选择抗菌药物治疗病原菌感染。HR菌株因难以被常规方法检出而漏检，在抗菌药物的选择压力下可能导致高水平亚群的出现，造成临床治疗失败和感染复发。随着碳青霉烯类抗生素应用增加，其相关的HR日益增多。目前，肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和大肠埃希菌等临床常见病原菌^[5-11]对碳青霉烯类抗生素的异质性耐药已有较多研究^[12]，但关于碳青霉烯类异质性耐药铜绿假单胞菌(carbapenem-heteroresistant Pseudomonas aeruginosa, CHPA)的相关报道较少。严格控制碳青霉烯类药物的使用对于减少PA感染者CHPA的发生至关重要。研究^[13]表明，2011—2015年CHPA的分离率呈逐年上升趋势，我国西南地区已广泛发现CHPA菌株，在侵袭性PA中，CHPA的检出率高达84.9%。CHPA的耐药机制至今尚未得到充分研究，CHPA的检测和鉴定也缺乏统一的标准。本文对CHPA的研究现状包括HR定义、检测方法、CHPA耐药机制、临床及流行病学特征进行综述，为临床诊断与治疗CHPA感染提供新思路。

1 HR的定义

HR指同一克隆菌株中同时存在对某种抗菌药物耐药及敏感亚群的现象，即体外药敏试验如K-B法检测细菌对某种抗菌药物的敏感性时，在抑菌圈内有相同种属的菌落生长^[14]。有临床意义的表型主要体现为大部分亚群敏感，但有一小部分亚群耐药，极少数亚群甚至出现高水平耐药。常规剂量抗菌药物作用下，这部分耐药亚群不能被杀死，可能导致临床应用抗菌药物治疗失败^[14-15]。

在研究PA的HR过程中，需要考虑以下几点：第一，耐药亚群的耐药水平。大多数研究采用最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)与最高不抑菌浓度(the highest noninhibitory concentration, HNIC)的比值表示耐药亚群的耐药水平^[16]。研究显示，不同细菌的异质性耐药水平略有差异。例如，鲍曼不动杆菌、PA和肺炎克雷伯菌的MIC和最高不抑菌浓度的比值>8时，判定为HR^{[1, 17]}；阴沟肠杆菌的MIC和最高不抑菌浓度的比值>2时，判定为HR^[18]。第二，耐药亚群频率。耐药亚群频率常用耐药亚群细菌数占细菌总数的百分比表示，即大于8倍MIC浓度的抗菌药物平板上生长的菌落数占无抗菌药物平板上生长的细菌总数的百分比。耐药亚群频率的检测极限在10^-7甚至更低，不同检测方法的敏感性有所差异^[19]。因此，有必要报告大于8倍MIC浓度抗菌药物平板的耐药亚群频率。第三，HR的稳定性。稳定性是指异质性耐药亚群在无抗菌药物培养基中连续传代后恢复亲代菌株耐药水平的能力。稳定性直接关系到HR的检测水平。在Wong等^[20]的研究中耐万古霉素葡萄球菌HR是稳定的，而部分研究^[21]中HR是不稳定的。CHPA通常表现为稳定的HR^[22-23]。

综上所述，在HR中，除了关注耐药亚群的存在，还应关注耐药水平、耐药频率和HR稳定性。

2 HR的检测方法

传统的微生物药敏试验不能识别出具有HR的菌株，导致HR漏检并可能导致抗菌药物治疗的失败。因此，及时、准确地检测HR菌株对于其所致感染的治疗非常重要。然而，HR的检测至今没有标准化方法，各实验室的检测方法也各有差异。常规的HR检测方法有改良K-B法、E-test法和菌群谱型分析法^[24]三种。近年来也开发出一些新的检测和辅助检测方法，如PAP曲线下面积法(PAP-AUC)^[25]、时间杀伤试验法^[26]、毛细管电泳法^[27]以及全基因组测序法^[28]等。

2.1 改良K-B法和E-test法

K-B法和E-test法常用于临床药敏试验，分别检测细菌对抗菌药物的抑菌圈直径和MIC值。采用这两种方法在抑菌圈内通常可直观发现可能存在的HR菌落，但假阴性概率较高。为了增加HR的检出率，Andersson等^[29]对美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)公布的药敏纸片扩散法进行了适当修改，即将菌液接种浓度从0.5增加到2.0麦氏单位，并将温箱孵育时间从24 h增加到48 h。具体方法为：将菌液调至2.0麦氏单位后，均匀涂布于M-H平板，贴相应的药敏纸片或E-test试条，37℃孵育48 h后观察结果^[25]。该方法有效降低了HR检测的假阴性率。研究^[21]表明，改良K-B法和E-test法仍存在较高的假阴性，只能用于HR的初筛。

2.2 菌群谱型分析法

菌群谱型分析法(population analysis profiling, PAP)被认为是HR检测的金标准^[14]。将过夜培养的菌液浓度调节至1.0×10⁷ CFU/mL，取20 μL涂布于梯度抗菌药物(具体浓度根据细菌MIC而定，如PA对美罗培南MIC折点值为2~8 mg/L^[30]，则可选择梯度抗菌药物板浓度为0.5~32 mg/L)平板上，37℃孵育48 h后计数菌落，其HNIC与MIC浓度比值大于8，则判定为HR。PAP结果可以提供耐药亚群频率和MIC等信息，但过程非常繁琐，通常只用于实验室研究和一些特殊临床病例。改良PAP方法采用微量稀释滴定^[31](取微量菌液滴定于抗菌药物滴度平板，不涂布均匀，观察细菌是否生长)，在节约成本的基础上，提高了HR的检出效率，但由于滴定的菌量相对较小，也可能存在假阴性。PAP是检测异质性耐药最可靠的方法，但由于其高成本和低效率的特点，在临床应用中难以实施。

2.3 PAP-AUC

PAP-AUC是一种改良的PAP，有研究将PAP-AUC作为检测异质性万古霉素中介金黄色葡萄球菌(heteroresistant vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus, hVISA)的金标准^[32]。具体操作如下：将过夜培养的菌液调节至1.0×10⁷ CFU/mL，取100 μL涂布于含有0.5、1、2、2.5和4 mg/L万古霉素的脑心浸液(brain heart infusion, BHI)平板上。在37℃孵育48 h后进行菌落计数，并使用GraphPad Prism软件将存活细菌数与万古霉素浓度作AUC曲线图，计算曲线下面积^[25]。与PAP相比，PAP-AUC操作更为繁琐，成本主要由筛选试验后所需的PAP-AUC检测次数决定。

2.4 时间杀伤试验法

在时间杀伤试验(time-killing assay)中，细菌在抗菌药物作用下，敏感菌群被杀死，但耐药亚群不断繁殖，会出现菌落数先下降后增加的现象^[33]。将过夜菌培养液浓度调节至大于1.0×10⁵ CFU/mL，在0.5~4倍MIC值梯度抗菌药物浓度作用下，通过记录2、4、6、8、10、12、24和48 h抗菌药物作用下细菌数量的变化作时间杀伤曲线来判读结果。时间杀伤曲线法可以作为HR的验证方法，但其灵敏度和准确度不及PAP，过程也相对繁琐，不适用于临床检测。此外，时间杀伤曲线法还可以用于检测抗菌药物联合应用的疗效，评估联合用药的协同作用^[34]。

2.5 毛细管电泳法

有研究表明毛细管电泳法(capillary electrophoresis, CE)可快速检测革兰阴性细菌对粘菌素的HR亚群。研究表明，CE法可以根据细菌的表面特性分离不同的菌株。通过简单的CE运行，只需几分钟，便能清楚地检测出细菌亚群是否共存^[27]。这种新兴的细菌亚群检测技术尚未成熟，有待研究并应用于HR的检测。

2.6 全基因组测序法

全基因组测序法(whole genome sequencing, WGS)已应用于细菌亚群的分析。通过分析耐药亚群基因型的变化，检测出HR。研究^[28]表明在金黄色葡萄球菌和结核分枝杆菌中，WGS的准确度高于传统表型检测，但在耐药亚群频率小于10^-2时灵敏度不高。也有研究^[35]表明WGS不能准确检测出肠道沙门氏菌的HR亚群。全基因组测序的分析相对复杂，对生物信息学有较高的依赖性，尚未应用于临床检测。

综上所述，为了防止CHPA的临床治疗失败和耐药菌株的传播，有必要规范PAP的操作流程，并发展出更高敏感性、更高重复性和简便的新兴检测技术(例如，在同一M-H平板中设置不同抗菌药物梯度形成梯度抗菌药物平板等^[29])用于临床试验。

3 CHPA的异质性耐药机制

HR菌株难以被临床微生物自动化仪器检出，长期用药可能导致高水平耐药亚群的出现，造成临床治疗失败和感染复发。因此，研究HR机制对耐药性监测和患者预后至关重要。自1947年首次发现HR现象以来，几乎在所有革兰阳性菌和革兰阴性细菌中都发现了HR。临床分离的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗菌药物均具有明显的异质性耐药；但只有少数文献报道了可能与CHPA相关的耐药机制，例如，生物膜形成、外排泵MexAB、MexCD的高表达和膜孔蛋白OprD的缺失等^[36-38]。AmpC过表达与CHPA的关系尚有争议，Cabot等^[37]认为AmpC过表达是CHPA最主要的机制，而He等^[13]则认为AmpC可能不参与PA的HR。

机制研究表明，外排泵系统的过表达和膜孔蛋白的表达下调可能是PA对碳青霉烯类抗生素异质性耐药的主要机制。PA通过阻止抗菌药物进入细菌或增加抗菌药物的排出，以达到对抗菌药物耐药的目的。

3.1 外排泵系统的过表达

Ikonomidis等^[36]指出CHPA的机制与外排泵基因表达上调有关。与亲代菌株相比，HR菌株外排泵相关基因包括mexB、mexC、mexE和mexX的表达都出现上调。值得注意的是，亚胺培南异质性耐药(imipenem heteroresistance, IPM-HR)菌株中mexB和mexE均表现出明显上调，美罗培南异质性耐药(meropenem heteroresistance, MPM-HR)菌株中mexE表现为明显上调，而mexB与亲代菌株水平无明显差异。这一现象可能是由于亚胺培南的化学结构中缺乏一个可以被MexAB-OprM系统识别的杂环侧链^[38]。

3.2 膜孔蛋白OprD基因表达下调

PA的HR亚群还表现出OprD基因和蛋白的表达显著降低^[36]。外排泵的上调和OprD基因的下调在一定程度上都促进了CHPA对碳青霉烯类抗生素HR的产生^[38-39]。

3.3 生物膜的形成

大量研究^[13]表明，所有CHPA的生物膜都明显增加。生物膜延缓了抗菌药物的渗透，降低了微生物的生长速度，从而促进了具有不同抗性水平的亚群在细菌群体中的出现。生物膜的检测一般分为定性法和定量法两种，定性法是指利用荧光显微镜、相差显微镜或者扫描电镜观察细菌生物膜形态，定量法指半定量结晶紫法或者生物膜内的活菌计数法等。前者较后者更为直观。

另外，He等^[13]通过PCR检测CHPA分离株是否产金属β-内酰胺酶(metallo-β-lactamase, MBLs)，发现CHPA中MBLs基因型阴性^[5]，与一般耐药机制不同。这与吴婷婷关于铜绿假单胞菌亚胺培南异质性耐药机制的研究结果一致^[34]。因此，CHPA的耐药机制可能与外排泵系统、膜孔蛋白以及生物膜的产生有关，与MBLs的产生无关。

4 CHPA的临床及流行病学特征

尽管CHPA在世界范围内已被观察到，但其流行病学资料不多^[40]。在我国CHPA感染患者中，IPM-HR(41.9%，189/451)和MPM-HR(72.5%，327/451)分离株所致感染比例较高。IPM-HR分离株的分离率2011年为41.7%，2015年增加至62.1%，MEM-HR分离率也出现了上升趋势^[13]。马幸延等^[41]检测了169株临床分离的PA对多种抗菌药物的药敏情况，检出并确认了50株CHPA菌株，检出率为29.59%。其中MPM-HR株和IPM-HR株的检出率分别为26.04%(44/169)和13.02%(22/169)，同时对这两种抗菌药物均异质性耐药的菌株检出率为9.47%(16/169)。如前所述，常规临床药敏试验难以检测出HR的存在，HR菌株通常被判定为敏感菌株^[42]。在PA的感染中，这将导致HR亚群用常规剂量碳青霉烯类抗生素治疗失败。

5 小结与展望

目前，碳青霉烯类抗生素已成为治疗PA感染的主要抗菌药物，随着用药率的增加HR亚群频率也出现上升。为控制CHPA的感染和传播，使用抗菌药物应遵循以下两种方式：第一，换用无HR现象的敏感抗菌药物，以较低的剂量达到抗菌目的；第二，联合用药，利用协同效应达到治疗效果。两种方式中应优先考虑前者。

HR机制十分复杂，至今尚未明确。HR可能是细菌自然进化的工具，因为其为细菌提供了在抗菌药物压力下继续生存的机会^[43]。深入和全面地了解CHPA耐药机制，将有助于指导临床合理用药，减少临床碳青霉烯类抗生素治疗PA感染的失败。PAP作为检测HR的金标准，有必要简化其检测流程，例如，采用微量稀释滴定PAP或者设计梯度抗菌药物PAP平板，标准化PAP操作流程。同时，发展高效快速的新兴检测技术，为临床诊断和治疗CHPA感染提供参考，减少住院患者CHPA的感染和传播。