流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)主要定植在咽喉及口腔黏膜，当机体免疫功能低下时，可引起急性咽炎、喉炎、气管炎、肺炎、中耳炎、鼻窦炎、心内膜炎、败血症、脑膜炎等急性化脓感染及严重的继发感染^[1]。流感嗜血杆菌是引起儿童呼吸道感染的主要病原菌，其感染人群、流行季节、耐药性等均呈现地域性差异^[2-3]。流感嗜血杆菌是海口地区引起儿童呼吸道细菌感染的首位病原体^[4]，严重危害该地区儿童健康。为进一步了解海口地区儿童肺炎来源的流感嗜血杆菌临床特征、耐药性，以及其群体结构、克隆在社区传播情况，对2021年海口市妇幼保健院住院肺炎患儿分离的流感嗜血杆菌进行研究，旨在为该地区预防和治疗儿童流感嗜血杆菌性肺炎提供理论依据。

1 对象与方法 1.1 研究对象

选取2021年因肺炎在海口市妇幼保健院住院治疗的患儿为研究对象，分析患儿痰、肺泡灌洗液标本细菌培养出流感嗜血杆菌情况，剔除同一患儿同次住院重复菌株。儿童社区获得性肺炎(CAP)诊断标准参照2019年版《儿童社区获得性肺炎诊疗规范》^[5]。患儿入院后24 h内通过一次性无菌吸痰管负压吸取痰标本送检，痰合格标准为：白细胞＞25个/低倍视野，鳞状上皮细胞＜10个/低倍视野。对于肺部感染导致的肺实变、肺不张患儿，通常进行支气管肺泡灌洗治疗，并取灌洗液送检。随机留取流感嗜血杆菌感染高发的春季中1—2月份分离的流感嗜血杆菌菌株，进行多位点序列分型(MLST)同源性检测分析。

1.2 仪器与试剂

哥伦比亚血平板、嗜血杆菌巧克力平板、MH平板购自广州迪景微生物科技有限公司，HTM平板购自郑州安图生物工程股份有限公司，细菌鉴定采用法国梅里埃VITEK 2全自动细菌鉴定分析仪及其配套的NH鉴定卡，头孢硝噻吩纸片、因子纸片购自温州康泰生物科标技有限公司，药敏纸片购自英国OXOID公司和温州康泰生物科技有限公司，标准菌株流感嗜血杆菌ATCC 49247、啮蚀艾肯菌ATCC BAA-1152、金黄色葡萄菌ATCC 29213、金黄色葡萄菌ATCC 25923、副流感嗜血杆菌等均购自温州康泰生物科技有限公司，PCR扩增仪、PCR反应试剂、电泳仪、凝胶程序成像系统、引物合成、测序等均由武汉天一华煜基因科技有限公司提供。

1.3 培养鉴定及药敏试验

标本接种于哥伦比亚血平板和嗜血杆菌巧克力平板，置5%CO₂培养箱35℃培养过夜，挑取巧克力平板上湿润、透明的露滴状疑似菌落采用Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子生长需求试验进行初筛，初筛阳性菌株用梅里埃VITEK 2 Compact细菌鉴定仪及其配套的NH卡鉴定确认。挑取流感嗜血杆菌调成0.5麦氏单位菌悬液均匀涂布于HTM平板上，采用K-B纸片扩散法进行药敏试验，结果判读按照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2021标准进行。采用啮蚀艾肯菌ATCC BAA-1152对NH鉴定卡进行质量控制，采用流感嗜血杆菌ATCC 49247、副流感嗜血杆菌对Ⅴ、Ⅹ、Ⅴ+Ⅹ因子纸片进行质量控制，采用流感嗜血杆菌ATCC 49247对HTM平板及K-B法药敏纸片进行质量控制。

1.4 β-内酰胺酶检测

采用头孢硝噻吩纸片蘸取待测菌，10 min后观察颜色变化，出现红色为阳性，即产β-内酰胺酶；1 h后无颜色变化为阴性，即不产β-内酰胺酶。采用金黄色葡萄菌ATCC 29213进行阳性质控，金黄色葡萄菌ATCC 25923进行阴性质控。

1.5 MLST

(1) 细菌DNA提取：采用煮沸法。吸取100 μL DNA提取液于离心管中，直接挑取流感嗜血杆菌菌落于DNA提取液中制成悬液，将离心管置于金属加热器中100℃ 10 min，再置于高速离心机12 000×g离心5 min，取上清液(即为DNA模板)4℃保存备用。(2)PCR扩增：反应总体积30 μL，包括MasterMix 15 μL，无菌水12 μL，上游引物(浓度10 mmoL)、下游引物(浓度10 mmoL)各1 μL，DNA模版1 μL。反应条件为95℃预变性5 min，95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，72℃末端延伸5 min。取2 μL PCR产物加2 μL 6×Loading Buffer进行电泳前处理，再取适量样品至1%琼脂糖凝胶孔中，120 V电泳20 min，采用凝胶成像分析仪进行拍照检测。见表 1。(3)测序分型：将PCR产物连同相应的测序引物送Sanger测序公司进行双向测序(每个样品配5 μL上、下游测序引物，引物浓度10 μmoL)，测序平台为ABI公司的3730xl DNA Analyzer测序仪。测序结果提交MLST数据库(http://enterobase.warwick.ac.uk/species/index/mcatarrhalis)，获得各等位基因序列号并确定菌株序列型(sequence type，ST)。

1.6 统计学方法

应用WHONET 5.6软件对药敏结果进行统计处理，应用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计数资料比较采用χ²检验，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 一般情况

5 342例患儿共检出流感嗜血杆菌352株，检出率为6.59%。其中男患儿检出率为7.10%，女患儿检出率为5.82%，见表 2。男女患儿流感嗜血杆菌检出率比较，差异无统计学意义(P=0.066)。送检标本中，痰标本5 325份，肺泡灌洗液标本17份，分别检出流感嗜血杆菌349、3株，检出率分别为6.55%、17.65%。

2.2 不同年龄段检出情况

流感嗜血杆菌检出率以4岁~最高(12.88%)，2岁~次之(11.62%)，≥6岁为2.56%，＜30 d最低(0.30%)，各年龄段比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表 2。

2.3 不同季节检出情况

流感嗜血杆菌全年均可流行，春季(1~3月)、夏季(4~6月)、秋季(7~9月)、冬季(10~12月)流感嗜血杆菌检出率分别为14.04%、4.48%、4.62%、4.40%，以春季检出率最高, 见表 2。不同季节检出率比较，差异有统计学意义(P＜0.001)。

2.4 耐药情况

仅331株流感嗜血杆菌进行了药敏检测，对氨苄西林的耐药率为69.19%，β-内酰胺酶检测阳性率为42.60%(141/331)，β-内酰胺酶阳性菌株对氨苄西林的耐药率为100%，β-内酰胺酶阴性菌株对氨苄西林的耐药率为26.58%。流感嗜血杆菌对复方磺胺甲唑的耐药率最高(76.43%)，其次是头孢呋辛(51.36%)、阿奇霉素(29.31%)、阿莫西林/克拉维酸(20.24%)，对头孢他啶和头孢曲松的耐药率均为17.52%，对美罗培南和左氧氟沙星的耐药率极低(均＜1%)。见表 3。

2.5 MLST结果

选取51株流感嗜血杆菌进行MLST，被分为15个ST型，序列峰图见图 1。其中ST107最多(11株，21.57%)，其次为ST422(6株)、ST103(5株)、ST57(5株)、ST11(4株)、ST12(4株)，其余型别为ST139、ST321、ST481各3株，ST836 2株，ST159、ST165、ST183、ST388、ST396各1株。克隆型最多的ST107主要分布在4个月~1岁患儿(9株)和3岁患儿(2株)，男患儿、女患儿分别检出5、6株；其次克隆型较多的ST422、ST103、ST57有80%以上分布在1个月~3岁，男患儿检出多于女患儿(男10株，女6株)。4种优势克隆型对氨苄西林、阿奇霉素、头孢呋辛、复方磺胺甲唑的耐药率均较高，见图 2。

3 讨论

本研究从肺炎患儿收集5 342份标本，排除咽拭子，以痰标本为主，且痰为负压吸取，减少了口咽部菌群的污染，数据更能客观反映下呼吸道感染的情况。共检出352株流感嗜血杆菌，总检出率为6.59%，肺泡灌洗液检出率为17.65%，远高于痰的6.55%，说明肺泡灌洗液对下呼吸道感染具有较高的敏感度和特异度。本研究流感嗜血杆菌总检出率比浙江嘉兴地区(3.34%)高^[3]，但比浙江玉环市(11.86%)^[6]、山东济南地区(12.58%)^[7]、河南济源市(10.94%)均低^[8]，可见不同地区的流感嗜血杆菌流行存在地域性差异。林翀等^[9]报道2012年海口地区检出率为18.6%，说明同一地区不同年度流感嗜血杆菌的感染流行也不同。流感嗜血杆菌的流行不仅呈季节性分布，各地区的流行季节也不尽相同。与文献^{[6, 10]}报道的冬季检出率最高不同，海口地区春季检出率最高，冬季检出率最低，与袁文清等^[11]报道一致，多个研究报道春季有较高检出率^{[7-8, 11-12]}，可能是春季冷暖交替，容易诱发流感嗜血杆菌相关呼吸道疾病，加上春季正值春节期间，人员流动性大，增加了感染风险。临床应重视春季此类疾病的防控，积极开展社区宣传工作，指导家属做好儿童防护工作。

本研究发现，新生儿流感嗜血杆菌检出率仅0.24%，检出率低的原因可能是新生儿与外界接触少，大多数新生儿肺炎都是吸入性肺炎，感染多由宫内感染或经产道感染，接触的细菌多为定植菌，与2020年该院统计的数据^[4]一致。本研究发现流感嗜血杆菌感染患儿没有男女性别差异，年龄集中在30 d~8岁，并且各年龄段之间存在差异，90%的感染发生在5岁以下儿童。30 d~患儿的病例数和流感嗜血杆菌构成比最高，但是检出率不高，检出率最高的年龄段是4岁~，其次是2岁~，≥6岁病例数明显降低，此现象可能与学龄前儿童免疫系统发育尚未健全，免疫功能低下有关，年龄、性别差异与全国多个地区报道^{[6-8, 11, 13]}一致。1~5岁儿童流感嗜血杆菌感染率高，估计与此年龄段儿童开始从家庭走进社区，与外界接触增多，感染风险也增加，也间接证明了流感嗜血杆菌克隆在社区传播。

本研究结果显示，流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药率高达69.19%，全国细菌耐药监测网(CHINET)监测数据显示2014—2019年其对氨苄西林的耐药率从48.1%上升到69.0%^[14]，说明氨苄西林已不适合作为治疗该菌的首选药物。本研究中流感嗜血杆菌β-内酰胺酶阳性率为42.60%，与秦惠宏等^[15]报道的40.4%相近，较2019年CHINET监测^[16]数据略低，且β-内酰胺酶阳性菌株对氨苄西林耐药率为100%，提示本地区流感嗜血杆菌产β-内酰胺酶是对氨苄西林耐药的主要机制。另外，本研究还发现β-内酰胺酶阴性菌株对氨苄西林耐药率为26.58%，说明除了产β-内酰胺酶，可能还存在别的耐药机制。文献^[17]报道，细菌ftsl基因突变会导致β-内酰胺酶阴性菌株对氨苄西林耐药。值得注意的是，对头孢呋辛的耐药率从2020年的16.85%^[4]升高到本研究的51.36%，推测与头孢呋辛是儿科的一线治疗药物，抗菌药物对菌株选择性压力高导致，也有文献^[15]报道是细菌ftsl基因突变引起。但本研究尚未对流感嗜血杆菌的耐药机制及耐药基因进行深入研究，不能深入阐述其耐药产生的机制，是否为细菌ftsl基因导致的耐药有待进一步研究。2014—2019年全国细菌耐药监测网^[18]数据显示，复方磺胺甲唑一直有较高的耐药率，本研究更是高达76.43%，高于吕志勇等^[19]报道的66.1%，与本地区2020年数据相比变化不大^[4]，说明复方磺胺甲唑已不适合作为治疗流感嗜血杆菌的常规药物。而阿莫西林/克拉维酸、阿奇霉素、头孢他啶、头孢曲松、美罗培南及左氧氟沙星的耐药率则较低，与2014—2019年全国细菌耐药监测网^[18]数据及林晓伟等^[20]报道一致，可以作为治疗选择药物，但耐药率逐年上升仍需引起重视。

MLST通常被用于细菌的基因分型，判定菌株亲缘关系，了解细菌的群体结构及分子流行病学特点。本研究中，51株流感嗜血杆菌被分为15个ST型，10个克隆群，其中ST107是海口地区春季优势克隆群，其次是ST422、ST103和ST57, 另外有5个独立ST型。由此可见，不同个体分离的流感嗜血杆菌ST型具有较大的差异，说明本地区流感嗜血杆菌的流行具有较多的遗传多样性，且具有克隆传播趋势。不足的是，本次用于MSLT的菌株数少，没有覆盖全年各个时间点，无法进行季节性分子流行病学比较。另外，国内尚未见流感嗜血杆菌的分子流行病学的文献，暂时无法进行地域性分子流行病学比较。

综上所述，本研究分离的流感嗜血杆菌来源于社区和深部痰标本，并且为感染病原菌。具有遗传多样性，其克隆已经在社区传播。春季是感染高发季节，ST107是海口地区春季优势流行克隆型，以2~3岁幼儿感染多见。流感嗜血杆菌对多种抗菌药物呈现高耐药率，复方磺胺甲唑、氨苄西林和头孢呋辛耐药率高须谨慎用于经验治疗，阿莫西林/克拉维酸耐药率和β-内酰胺酶阴性菌株氨苄西林耐药率升高，临床应引起重视。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。