2. 阜阳市疾病预防控制中心检验科, 安徽 阜阳 236030;
3. 马鞍山市疾病预防控制中心检验科, 安徽 马鞍山 243011;
4. 蚌埠市疾病预防控制中心检验科, 安徽 蚌埠 233000

2. Department of Laboratory Medicine, Fuyang Center for Disease Control and Prevention, Fuyang 236030, China;
3. Department of Laboratory Medicine, Ma'an- shan Center for Disease Control and Prevention, Ma'anshan 243011, China;
4. Department of Laboratory Medicine, Bengbu Center for Disease Control and Prevention, Bengbu 233000, China
致泻性大肠埃希菌(diarrheagenic Escherichia coli,DEC)仍是当前发展中国家引起急性胃肠炎的主要病原体之一,主要通过污染的食品或饮用水进行传播。可分为6种病理类型:肠致病性大肠埃希菌(EPEC)、肠侵袭性大肠埃希菌(EIEC)、肠聚集性大肠埃希菌(EAEC)、弥散黏附性大肠埃希菌(DAEC)、肠出血大肠埃希菌(EHEC)和肠毒素性大肠埃希菌(ETEC)。除DAEC无特异的毒力基因鉴定外,其余5种病理类型都可通过特异性毒力基因进行鉴定分型[1-2]。
DEC在夏秋季节常引起一些散发病例,偶尔也会发生一些聚集性病例。基因溯源在流行病学和疾病预防控制中非常重要,其中多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)和脉冲场凝胶电泳(pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)分型是较常用的基因溯源方法。PFGE分型选用适当的限制性内切酶在胶块中对整个细菌染色体进行酶切,360°电泳分离,最后根据分离的条带数和大小进行基因溯源[3]。MLST是对保守基因测序分型,分辨率高,数据重复性好,常用于细菌基因分型和进化研究[2, 4-6]。
本研究主要对安徽省连续2年临床分离的DEC分别用PFGE分型和MLST进行基因同源性分析,了解该地区DEC各致病型主要流行的基因型及同源性,并比对两种分型方法的优缺点。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株来源2018—2019年安徽省9个地市哨点医院采集的腹泻患者粪便标本分离的DEC。
1.1.2 主要仪器和试剂聚合酶链反应(PCR)仪(PTC-200) 购自美国MJ公司,凝胶成像仪Gel-DocXR购自美国Bio-Rad公司,CHEF-Mapper型脉冲场凝胶电泳仪购自美国Bio-Rad公司。GoTaq Green Master Mix (Lot: M7122) 购于Promega公司,XbaⅠ限制性内切酶购于TaKaRa公司。
1.2 方法 1.2.1 药敏试验采用微量肉汤稀释法进行药敏试验,试验方法及药物的选择参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)—2019[7]标准。挑取新鲜纯菌落3~5个,用无菌水配制成0.5麦氏单位的菌悬液,吸取60 μL加入12 mL肉汤管中充分混匀。向96孔药敏板中每孔加入100 μL(约5×105 CFU/mL) 的肉汤菌悬液,置湿盒中36 ℃培养20 h[8]。质控菌株:大肠埃希菌ATCC 25922和金黄色葡萄球菌ATCC 25923。
1.2.2 MLST随机对2018年临床分离的DEC进行基因测序分型。根据E.coli数据库提供的大肠埃希菌MLST方案,参考数据库和文献合成引物[8],配制50 μL PCR扩增体系:GoTaq Green Master Mix 2 μL,10 μmol/L的上下游引物各2 μL,无RNA酶水19 μL,DNA模板2 μL。PCR扩增条件参照文献[9]。收集PCR产物,纯化后进行测序[2]。将基因序列导入E.coli MLST数据库中获得相应的ST型,将7对管家基因序列按(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA)顺序连接后,用MEGA v6.0构建微进化树[minimum-evolution (ME) tree][4, 10]。
1.2.3 PFGE分型对2019年临床分离的DEC进行PFGE分型。①首先制备1% SeaKem Gold plug:调制4.0~4.5麦氏单位的菌悬液,吸取400 μL菌悬液至EP管中,每管中加入400 μL SeaKem Gold,充分混匀后加入plug模具中,室温凝固30 min;细菌裂解,将制备好的1% SeaKem Gold plug加入CLB裂解液中54℃温育2 h;②Plug清洗:用无菌超纯水洗2次,TE缓冲液洗4次;③DNA酶切:取出plug,切成约2.0 mm宽的小胶条,加入200 μL XbaⅠ酶切液,37℃水浴2 h;④酶切片段电泳:将酶切后的小胶条粘贴在梳齿上,倒入1% SKG,待胶块凝固后电泳[3]。Bionumerics 6.6软件分析。
2 结果 2.1 检出菌株情况2018—2019年,全省9个地市哨点医院共采集1 920例腹泻患者粪便,分离DEC 268株。病理类型为:EAEC 118株(44.0%),其中非典型EAEC(aEAEC) 80株(29.9%),典型EAEC(tEAEC)38株(14.2%);ETEC 98株(36.6%),其中ETEC 92株(34.3%),ETEC+aEAEC 6株(2.2%);EPEC 47株(17.5%),其中非典型EPEC(aEPEC)45株(16.8%),典型EPEC(tEPEC)2株(0.7%);EIEC 5株(1.9%)。病原菌来源地分布:马鞍山市78株(29.1%),阜阳市62株(23.1%),合肥市50株(18.7%),蚌埠市27株(10.1%),淮南市18株(6.7%),亳州市16株(6.0%),池州市7株(2.6%),滁州市6株(2.2%),芜湖市4株(1.5%)。
2.2 药敏结果268株DEC中,57.1%的菌株为多重耐药菌,对氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、头孢唑林、庆大霉素、四环素、氯霉素、萘啶酸、环丙沙星和复方磺胺甲
表 1 四种致病型DEC对13种抗菌药物的药敏结果[株(%)] Table 1 Antimicrobial susceptibility testing results of 4 types of pathogenic DEC to 13 kinds of antimicrobial agents (No. of isolates[%]) |
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随机对2018年临床分离的127株DEC进行MLST,共获得60个ST型,其中EAEC和ETEC少数菌株存在ST48和ST394型交叉。55株EAEC分为35个ST型,优势基因型是ST10(14.5%);55株ETEC分为14个ST型,优势基因型是ST48(32.7%)和ST218 (16.4%);15株EPEC分为12个ST型,优势基因型是ST28、ST517和ST2088,各占13.3%;2株EIEC分为ST6和ST99。见表 2。15株EPEC微进化树分析有2组100%同源,其中1组4株(2株分离自马鞍山市,1株分离自合肥市,1株分离自芜湖市),另1组2株菌分离自马鞍山市,见图 1。55株ETEC微进化树分析有5组100%同源,其中1组5株菌分离自马鞍山市,另有2组2株菌均分离自马鞍山市,还有1组9株菌(5株分离自合肥市,3株分离自马鞍山,1株分离自阜阳市),见图 2。55株EAEC微进化树分析有4组100%同源,其中1组3株(2株分离自阜阳市,1株分离自合肥市),1组2株分离自滁州市,其余2组2株菌均分离自不同地方,见图 3。
表 2 主要致病型DEC的MLST结果 Table 2 MLST results of main pathogenic DEC |
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图 1 15株EPEC微进化树图(MEGA v6.0) Figure 1 Minimum-evolution tree of 15 EPEC strains (MEGA v6.0) |
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图 2 55株ETEC和2株EIEC微进化树图(MEGA v6.0) Figure 2 Minimum-evolution tree of 55 ETEC strains and 2 EIEC strains (MEGA v6.0) |
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图 3 55株EAEC微进化树图(MEGA v6.0) Figure 3 Minimum-evolution tree of 55 EAEC strains (MEGA v6.0) |
2019年临床分离的109株DEC基因同源性聚类分析结果显示,50株EAEC(tEAEC 18株,aEAEC 32株)中有2株100%同源,分离自蚌埠市,其余菌株同源性均在90%以下,见图 4;21株EPEC同源性均在75%以下,见图 5。30株ETEC、3株EIEC和5株ETEC+aEAEC中,同源性达97.6%、93.6%各2株,其余菌株同源性均在90%以下,见图 6。
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注:2019年安徽地区分离的50株EAEC与数据库中2014年已上传的10株EAEC聚类分析;Fuyang City为阜阳市,Funan County为阜南县,Hefei City为合肥市,Bengbu City为蚌埠市,Ma’anshan City为马鞍山市,Huainan City为淮南市,Bozhou City为亳州市,Lu’an City为六安市。 图 4 60株EAEC的PFGE同源性聚类图 Figure 4 PFGE homology clustering diagram of 60 EAEC strains |
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注:2019年安徽地区分离的21株EPEC与数据库中2013—2014年已上传的13株EPEC聚类分析;Fuyang City为阜阳市,Funan County为阜南县,Hefei City为合肥市,Bengbu City为蚌埠市,Ma’anshan City为马鞍山市,Huainan City为淮南市,Bozhou City为亳州市。 图 5 34株EPEC的PFGE同源性聚类图 Figure 5 PFGE homology clustering diagram of 34 EPEC strains |
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注:2019年安徽地区分离的30株ETEC、3株EIEC、5株ETEC+aEAEC与数据库中2013年上传的4株ETEC和1株EIEC聚类分析;Fuyang City为阜阳市,Funan County为阜南县,Hefei City为合肥市,Bengbu City为蚌埠市,Ma’anshan City为马鞍山市,Huainan City为淮南市,Bozhou City为亳州市。 图 6 43株ETEC和EIEC的PFGE同源性聚类图 Figure 6 PFGE homology clustering diagram of 43 ETEC and EIEC strains |
本研究资料显示,安徽地区流行的DEC存在4种优势毒株,其中以EAEC为主,占44.0%,其次是ETEC(36.6%)、EPEC(17.5%)和EIEC(1.9%),未从患者粪便中检测出EHEC,提示本地区流行的DEC主要是EAEC、ETEC和EPEC,与张子科等[11]统计的结果基本相吻合。
药敏试验结果显示,临床分离的DEC毒株多重耐药菌检出率高达57.1%,对氨苄西林、萘啶酸和头孢唑林的耐药率较高,耐药情况较严重,较之前的药敏监测结果略有升高[12],与相关研究[13-14]报道的结果近似,提示我国多省份DEC的耐药情况较严重。本研究发现EAEC对头孢唑林和头孢他啶的耐药率分别为53.4%、15.2%,明显高于ETEC的35.7%、6.1%,以及EPEC的34.0%、4.3%。EPEC对萘啶酸和头孢噻肟的耐药率分别为34.0%、19.1%,明显低于EAEC的65.3%、40.7%,以及ETEC的75.5%、27.6%。ETEC对四环素、复方磺胺甲
2019年复旦大学附属华山医院的监测数据[15]显示,耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(CRE)检出率为20.4%,肺炎克雷伯菌中耐碳青霉烯类菌株检出率为42.9%,临床耐药菌株尤其是CRE呈增长趋势。但DEC中近年才检出CRE,本研究在2013—2018年的监测数据中均未发现耐碳青霉烯类DEC,仅2019年发现2株EAEC和1株ETEC对亚胺培南耐药,后续将对其耐药机制和传播机制进行研究。
MLST结果显示,127株DEC共检出60个ST型,呈高度多态性。其中55株EAEC分为35个ST型,以ST10(14.5%)和ST34(5.5%)略占优势,与Okeke等[16]报道Nigeria临床分离的126株EAEC多达96种ST型的多态性分布相近。微进化树分析显示,有少数菌株呈100%同源,但空间分布广泛,提示无聚集性感染。50株EAEC的PFGE同源性聚类分析仅有2株出现100%同源性,分离自蚌埠市,其余菌株的同源性均小于90%。同样提示EAEC高度多态性分布,无聚集性感染。Li等[5]报道深圳地区分离的ETEC基因型较分散,ST218为相对优势基因型,本研究中55株ETEC分为14个ST型,优势基因型是ST48(32.7%)、ST218 (16.4%)和ST1491(12.7%),说明本地区临床分离的ETEC基因型较集中,ST48为主要优势基因型,提示不同地区ETEC基因型存在差异性。55株ETEC微进化树分析发现有多达5组100%同源,其中有多株菌分离自马鞍市,提示存在地区聚集性感染的可能性,但流行病学调查未发现暴发或聚集性病例。研究发现同源性感染存在时间差异,因此未出现聚集性病例,可能与菌株的克隆传播有关。30株ETEC PFGE同源性聚类分析发现,同源性达97.6%、93.6%各2株,其余菌株同源性在90%以下。15株EPEC分为12个ST型,呈多态性分布,其中以ST28(13.3%)、ST517(13.3%)和ST2088(13.3%)略占优势。15株EPEC微进化树分析显示,少数菌株呈100%同源性,空间分布广泛,提示无聚集性病例出现。21株EPEC PFGE同源性聚类分析显示同源性均在75%以下。
PFGE和MLST同为两种分子分型方法,两者各有优缺点,可以互为补充用于致病菌的分型和基因溯源分析。从本研究分型结果看,两者作用相同,均可用于分析致病菌的同源性,并且两种分型方法获得的结果也近似。但MLST是通过基因测序,其准确度要高于PFGE法,在本研究中MLST法对ETEC同源性的判断要比PFGE法更精准。但PFGE法的优势是普及程度高,可用于大范围多样本的分析判断。
利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。
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