近年来，随着内镜技术的发展及在临床中的广泛应用，软式内镜使用后的清洗和消毒流程越来越受到关注。终末漂洗作为软式内镜清洗、消毒后的最终处理过程，若漂洗水中细菌含量长期过高极易造成消毒流程的失败，并导致内壁生物膜的缓慢形成。为此，《软式内镜清洗消毒技术规范》WS 507—2016^[1]要求软式内镜使用纯化水或无菌水进行终末漂洗，并应保证纯化水细菌总数≤10 CFU/100 mL。然而，国内研究^[2-3]指出自来水经过纯水制备系统后，水中细菌含量反而增高的现象，在新建内镜中心的水管路中尤为常见^[4]。

上海市三级医疗机构软式内镜终末漂洗尽管已经加装纯化水过滤装置，但终末漂洗水合格率仅为63.09%，且水管路使用年限越久其合格率越低^[5]。2021年11月，复旦大学附属中山医院内镜中心对消化内镜的终末漂洗水监测发现，纯化水中菌落数明显高于《软式内镜清洗消毒技术规范》WS 507—2016的要求。为此，复旦大学附属中山医院内镜中心联合医院感染管理科对此进行调查和分析，制定消毒和监测措施，最终使终末漂洗用水符合要求。

1 对象与方法 1.1 调查对象

内镜中心自动清洗设备和手工清洗设备。其中胃镜和肠镜的手工清洗设备、18台自动清洗设备、终末水管路均为2017年10月份新改造后投入使用。纯化水制备的机器设在内镜中心独立的处置室，由厂家每半年对纯化水滤膜进行更换，每月使用邻苯二甲醛对水管路进行消毒和水样送检。

1.2 研究方法 1.2.1 采样方法

采集清洗消毒开始前胃镜和肠镜的手工清洗槽、胃镜清洗机和肠镜清洗机的终末漂洗水样，每个采样点采集100 mL的水样，采样时间为安装前第30、15、3天，安装后第1、2、4、7、10、14、21、28天。将收集好的终末漂洗水使用一次性过滤杯富集细菌至底部滤膜。将胃镜手工清洗槽水样本的滤膜装至50 mL离心管中，加入5 mL无菌水后离心振荡混匀，取其中1 mL进行宏基因组二代测序(metagenomics next-generation sequencing，mNGS)。剩余样本的滤膜依据《中华人民共和国药典(2020年版)》标准无菌操作转移至R2A琼脂培养平板，置于培养箱35℃培养5 d。

1.2.2 水路的改造和监测

根据首次纯水监测结果，于2021年12月引入微酸性次氯酸水发生机，向纯化水管路中恒定输出次氯酸，使纯化水中次氯酸终浓度为10 mg/L。在设备安装后的第1、2、4、7、10、14、21、28天按照1.2的方法进行采样、培养和鉴定，以及mNGS测序分析。

1.2.3 细菌鉴定

使用无菌接种环挑取培养阳性标本中典型、单个菌落涂抹至基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALID-TOF)仪样品检测板上，随后滴加1 μL的α-氰基-4-羟基肉桂酸溶液覆盖，直至基质液干燥后采用MALID-TOF进行菌种鉴定。以VITEK MS置信度≥99%的细菌名称作为菌种鉴定结果。

1.2.4 宏基因测序分析

样本使用玻璃珠混合振荡破壁，随后使用TIANamp Micro DNA Kit试剂盒提取样本的DNA; 使用Agilent 2100 Bioanalyzer和定量PCR法进行DNA文库的打断、构建和质控，随后经滚环复制生成DNB纳米球，并滴加至测序芯片中。使用BGISEQ-200进行测序分析，测序完成后去除低质量和DNA片段＜35 bp的数据，经专用微生物大数据库比对后生成细菌的种类、相对丰度、严格比对序列数(strict mapping reads number，SMRN)，标准化为1M序列值(reads per million，RPM)所包含的高质量细菌序列数值等数据。

1.2.5 结果判定

根据《软式内镜清洗消毒技术规范》WS 507—2016^[1]要求将滤膜培养结果＞10 CFU判定为水样不合格，其余判定为合格。根据《高通量宏基因组测序技术检测病原微生物的临床应用规范化专家共识2021》《宏基因组学测序技术在中重症感染中的临床应用专家共识(第一版)》^[6-7]等指南与既往临床分析经验，将SMRN≥50的细菌属(或种)纳入数据分析，并将种SMRN值＜RPM值的细菌属(或种)判定为mNGS背景细菌，并进行汇总和排序分析。

1.3 统计学方法

收集各样本检出细菌的种类、高质量细菌序列、属SMRN、种SMRN。将每个样本的细菌种SMRN进行排序，并取前10位进行汇总。应用SPSS 25.0进行数据的录入和分析，率的比较采用Fisher’s确切概率法，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 安装前后水样合格情况

安装前共采集水样27份，其中10份合格，合格率为37.03%;安装后共采集水样54份，54份均合格，合格率为100%，安装前后合格率经Fisher’s确切概率法比较，差异有统计学意义(P＜0.001)。见表 1。

2.2 细菌鉴定结果

17份不合格水样经MALID-TOF鉴定显示，10份检出放线根瘤菌，5份检出嗜麦芽窄食单胞菌，2份检出黄色微杆菌，5份检出贪铜菌，4份检出藤泽甲基杆菌，2分检出少动鞘氨醇单胞菌。见图 1。

2.3 水样本mNGS测序分析

mNGS测序数据显示，各样本的测序深度为1.40~61.90 M，RPM为231~3 063。消毒前，高质量细菌序列平均为112 291，消毒后为23 626;消毒前，细菌属SMRN平均为83 791，消毒后为11 496;消毒前，细菌种SMRN平均为61 274，消毒后为8 454。见表 2。

2.4 水样本中细菌基因多态性分析

将各样本中细菌种SMRN进行排序，并取前10位进行汇总。结果显示，安装前的样本中可检测出大量皮氏罗尔斯顿菌、耐金属贪铜菌、奥斯陆莫拉菌、日本慢生根瘤菌、水生甲基杆菌、戈登分枝杆菌、新鞘氨醇杆菌等水生细菌。安装后，所有样本的测序结果为mNGS背景菌。见表 3。

3 讨论

医疗用水主要来自市政自来供水或二次供水，停滞的水流和复杂而狭长的供水管道为水源性细菌的繁殖提供了有利条件，因此，医疗用水在使用、储存、输送过程中极易受到微生物的污染^[8]。国内外研究^[9-10]表明，终末漂洗水的合格率仅为40%~70%，是造成后续内镜污染的重要原因之一。若终末漂洗水管路长期未消毒，内镜内壁可形成以奥斯陆莫拉菌、嗜麦芽窄食单胞菌、铜绿假单胞菌、藤黄微球菌等水生类细菌为主的生物膜^[11-12]，给内镜的消毒和感染预防带来巨大挑战。

本研究3次基线采样显示，终末漂洗水中可鉴定出大量的放线根瘤菌、嗜麦芽窄食单胞菌、黄色微杆菌、贪铜菌、藤泽甲基杆菌、少动鞘氨醇单胞菌等水源性细菌，总合格率仅为37.03%。尽管自动清洗机和手工槽的终末漂洗水均来源于内镜中心独立的纯化水处理室，且该处理室定期进行滤膜更换和水管路消毒，但11份自动清洗机的终末水样仅有1份合格，而16份手工清洗槽的水样有9份合格。尽管缺乏对水管路中细菌生物膜的鉴定标准，但结合既往研究^[11]结论以及放线根瘤菌、贪铜菌、藤泽甲基杆菌在多次采集的样本中反复存在，mNGS高测序数据也证实此类细菌大量存在，因而推测纯化水制备点至出水口的管路已形成细菌生物膜，并持续性向纯化水管路中播散多种细菌。研究^[13]指出，随水流播散的细菌易造成过滤的膜孔堵塞，导致纯化水在滤过和储存过程发生二次污染。王晓蕾等^[14]对内镜终末漂洗水的连续监测显示，自来水经纯化水系统制备后细菌含量反而增高至218 CFU/mL。张枭然等^[4]对新建内镜中心的验收发现，尽管制水端的市政自来水、纯水制备位点未检出菌落，但进入内镜手工清洗设备前的水样与纯水箱回水口检出的菌落数较高，表明纯化水的出水管路极易受到污染。

由于细菌生物膜表面通常由多种细菌以及多聚物、蛋白质、核糖类物质所组成的聚合物包围，具有抵抗外界消毒剂的作用，并保护内部细菌结构和功能完整^{[12, 15]}。史庆丰等^[5]的研究表明含氯消毒剂、过氧乙酸、戊二醛等化学消毒法或臭氧、紫外线等物理消毒法存在作用时间短、浓度不足或穿透力差等问题，无法清除管路中已形成的生物膜。为此，内镜中心于2021年11月初引入微酸性次氯酸水发生机，向纯化水管路中恒定输出10 mg/L的次氯酸，进行持续性化学消毒。安装后的第1、2、4、7、10、14、21、28天培养结果显示，所有样本均未培养出细菌，显示该消毒方案的有效性。

本研究同时借助mNGS技术对终末漂洗水中细菌进行深度测序分析，结果显示消毒前水样不仅存在耐金属贪铜菌、奥斯陆莫拉菌、日本慢生根瘤菌、水生甲基杆菌、新鞘氨醇杆菌等与培养一致的细菌，同时还鉴定出皮氏罗尔斯顿菌^[16]、戈登分枝杆菌^[17]、约翰逊不动杆菌^[18]等潮湿环境普遍存在，但受培养条件所限而无法鉴定的细菌，显示mNGS对由复杂细菌所构成生物膜的鉴定优势。此外，mNGS在定性识别感染性病原体与优势细菌的构成研究中具有良好的应用效果^[19-21]，但对病原体的定量研究较为少见，尤其对同时涉及病原体种类和丰度的研究极为罕见。mNGS测序分析时，由于背景细菌的存在将影响临床样本以及环境样本的结果解读，前者可依据临床经验和测序数据综合分析而判别，但目前尚缺乏环境样本中目标菌和背景菌的判别标准和检测阈值。本研究经验性将种(属)SMRN＞RPM的细菌考虑为目标细菌，并结合培养结果以及安装前、后细菌种类和丰度的变化而综合分析消毒效果。结果显示，微酸性次氯酸水使用后的第1天，水样中高质量细菌序列、细菌属SMRN、细菌种SMRN数值显著降低，各样本种SMRN值均未超过相对应的RPM值。随后多个时间点所检测的水样培养结果阴性，且种SMRN排序前10的细菌多为背景细菌，因此推测该持续性消毒法已将水管路中持续存在的生物膜清除，具有良好的实用价值和推广意义。

本研究也存在以下局限：(1)采样时，未对新生成的纯化水添加中和剂，对培养结果具有一定的影响; (2)管路中的细菌生物膜是通过对纯化水的细菌培养结果，以及对消毒前、后的mNGS数据量变化情况进行间接验证，未能直接对水管路进行采样以及鉴定分析，未来需改进研究方法; (3)mNGS测序过程不可避免产生背景细菌数据，但国内尚无统一的鉴别标准和排除原则。本研究根据既往临床样本的数据及阴性对照管的细菌数据集，经验性将SMRN值过低的细菌且所有样本中频繁出现的细菌判定为背景细菌，该判定方法需进一步验证与评估。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。