2. 延边大学附属医院消化内科, 吉林 延吉 133000;
3. 延边大学附属医院感染科, 吉林 延吉 133000
2. Department of Gastroenterology, Yanbian University Hospital, Yanji 133000, China;
3. Department of Infection, Yanbian University Hospital, Yanji 133000, China
肝硬化是各种慢性肝病进展至以肝弥漫性纤维化、假小叶形成及肝内外血管增殖为特征的病理阶段，是一个全球性的公共健康问题[1]。细菌性感染在肝硬化患者中非常常见，并与并发症的发展和短期病死率高相关[2]。病理性细菌易位被认为是导致肝硬化细菌感染的重要机制[3]。研究[4-5]认为肠道屏障功能障碍与细菌易位和肝病进展相关。肠内物理屏障的维持取决于屏障成分的完整性，而细胞通透性增加和上皮细胞损伤可引起肠道屏障功能障碍[6]。研究[7]报道乳果糖/甘露醇测试作为肠道通透性标志物可用于评估肝病进展及预后，而关于肠道细胞完整性与肝硬化终点事件的研究鲜有报道。
肠脂肪酸结合蛋白(intestinal fatty acid bin-ding protein，I-FABP)是一种15 kDa蛋白质，位于成熟肠上皮细胞中。当肠黏膜损伤时，绒毛成熟上皮中的I-FABP以可溶形式释放到细胞外空间，因此被视为肠细胞损伤标志物[8]。研究[9]报道循环I-FABP是诊断肠道缺血性损伤的潜在标志物。另有研究[10]表明慢性乙型和丙型病毒性肝炎患者的循环I-FABP水平较无感染者明显升高，并与门静脉高压相关。在此背景下，课题组假设I-FABP与肝病程度及进展有关。因此，本研究的目的是评估：(1)I-FABP与肝病临床和实验室特征之间的关联；(2)I-FABP是否与肝硬化细菌感染及预后不良相关。
1 对象与方法 1.1 研究对象本研究是一项前瞻性研究，连续收集2020年9月—2022年5月住院治疗的肝硬化患者作为研究对象。肝硬化通过组织学或明确的临床和放射学发现得到证实。排除标准：(1)入院前进行血液透析；(2)活动性持续性胃肠道出血；(3)有任何感染源或正在接受抗感染治疗的患者；(4)肝内外恶性肿瘤；(5)过去两周使用抗菌药物、类固醇或免疫抑制药物；(6)与肝硬化无关的严重疾病、恶性肿瘤或怀孕的患者。本研究通过医院医学伦理委员会的审核和批准[(2020)伦审字(211)]。
1.2 研究方法在纳入当天评估患者肝硬化的病因、年龄、性别、腹腔积液和肝性脑病分级、合并用药、标准肝肾功能检查等临床参数。根据Child-Pugh评分将肝硬化患者分为A、B、C级。肝硬化的严重程度通过Child-Pugh分级和终末期肝病模型(model of end-stage liver disease，MELD)进行评估。入院时收集患者血清标本以3 000 r/min的速度离心10 min，将上清液储存在-80℃冰箱备用。根据指南管理肝硬化并发症[1]。每3个月对患者进行随访，随访时长至少12个月，随访时间计算为从入院诊疗到肝移植、死亡或门诊/电话进行最后一次随访的时间。另外，感染的最低限度检查应包括诊断性腹腔穿刺术、胸部X光检查、血培养、腹腔积液和尿培养以及皮肤检查。主要研究终点定义为随访期间肝硬化患者死亡或进行肝移植，次要研究终点为随访期间患者发生细菌感染情况。
1.3 仪器与试剂采用Sysmex XN-1000血细胞分析仪进行血常规检测，罗氏702生化分析仪进行生化检测，Stago凝血分析仪检测凝血时间。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清I-FABP的浓度。
1.4 统计学方法应用SPSS 17.0和GraphPad prism 7.0软件进行数据分析。呈正态分布的计量资料用x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。非正态分布的计量资料采用M(P25, P75)表示，两组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料采用χ2检验。两变量间相关性采用Spearman相关分析。多变量Cox回归分析肝相关死亡及细菌感染的预测因素。Kaplan-Meier方法分析时间相关终点事件发生率，通过对数秩检验评估差异。通过时间依赖性受试者工作特征(td-ROC)曲线比较预测因素在不同时间点肝相关死亡的应用价值。应用MedCalc软件比较各指标受试者工作特征(ROC)曲线的诊断性能，以P≤0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 研究人群一般情况本研究共纳入131例肝硬化患者，平均年龄(52.63±13.38)岁，男性88例，女性43例。随访期间有45例患者因细菌感染或感染发展住院治疗，其中22例出现2次及以上的感染，累计住院71次。感染住院中位时间为115(42, 251)d，平均住院时间15 d。最常见的感染是自发性细菌性腹膜炎(spontaneous bacterial peritonitis，SBP)，占20.6%(27例)，其次肺部感染占15.3%(20例)，泌尿道感染占9.2%(12例)，自发性或继发性菌血症占6.1%(8例)，脓毒症占1.5%(2例)。
将131例肝硬化患者按是否发生细菌感染分为感染组、未感染组。感染组患者的基线MELD评分、凝血酶原时间-国际标准化比值(PT-INR)、白细胞介素(IL)-6和I-FABP水平均高于未发生细菌感染患者；血小板计数(PLT)和血清清蛋白(ALB)低于未感染组患者；差异均有统计学意义(均P＜0.05)。见表 1。
| 表 1 研究人群基线特征 Table 1 Baseline characteristics of studied population |
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Spearman相关分析显示，I-FABP与IL-6(r=0.270，P＜0.001)、PT-INR(r=0.215，P=0.001)和SCr(r=0.430，P < 0.001)呈正相关，与ALB(r=-0.172，P=0.005)呈负相关。线性回归显示肝硬化患者的I-FABP水平随Child-Pugh分级增加而升高(P＜0.001)，Bonferroni校正后显示Child-Pugh C级患者I-FABP水平高于A、B级患者(P值分别为0.001、0.345)，I-FABP水平并随疾病严重程度增加而升高(Child-Pugh A级=1.18 μg/L，Child-Pugh B级=1.51 μg/L和C级=2.29 μg/L)，如图 1A所示。此外，I-FABP与MELD评分之间存在显著正相关(r=0.364，P＜0.001)，表明肠道屏障功能受损与疾病严重程度相关，如图 1B所示。
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| 注：A为Child-Pugh分级；B为MELD评分。 图 1 肝硬化患者I-FABP与疾病严重程度的相关性 Figure 1 Correlation between I-FABP and disease severity in patients with liver cirrhosis |
基线I-FABP水平与多数细菌感染的发生无关，肺部感染患者[1.13(0.77, 1.93) VS 1.71(0.89, 2.69)]、泌尿道感染患者[1.53(0.90, 2.64) VS 1.54(0.87, 2.35)]、菌血症患者[2.12(1.65, 2.83) VS 1.51(0.87, 2.52)]的I-FABP中位数水平与未发生其感染类型患者比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05)。然而，合并SBP患者的I-FABP中位数水平高于未发生者[2.26(1.58, 3.02) VS 1.25(0.80, 2.17)]，差异有统计学意义(P=0.001)。多因素Cox回归分析显示I-FABP和MELD评分是随访期间肝硬化患者发生SBP的预测因子(P值分别为0.002、0.013)。见表 2。
| 表 2 多变量Cox回归分析肝硬化合并SBP发生的预测因素 Table 2 Multivariate Cox regression analysis on the predictive factors for cirrhosis complicated with SBP |
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根据I-FABP四分位数(q1：＜0.87；q2：0.87~1.54；q3：1.54~2.55；q4：＞2.55)对研究队列进行分层，细菌感染的12个月累积发生率分别为4.3%、20.0%、45.2%、75.8%，SBP的12个月累积发生率分别为2.1%、15.0%、25.8%、45.5%，Kaplan-Meier曲线分析显示，基线I-FABP水平越高，随访期间发生细菌感染和SBP的概率也随之升高，如图 2所示。
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| 注：A为细菌感染累积发生率；B为SBP累积发生率。 图 2 按I-FABP四分位数分层的累积发生率Kaplan-Meier曲线图 Figure 2 Kaplan-Meier curve of cumulative incidence according to I-FABP quartile stratification |
ROC曲线分析I-FABP和MELD评分对SBP的预测性能，I-FABP和MELD的曲线下面积(AUC)分别为0.774、0.715，两者的预测效能比较差异无统计学意义(P=0.455)。I-FABP联合MELD评分的AUC为0.833(0.763~0.904)，此时灵敏度为68.27%，特异度为88.89%。如图 3所示。
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| 图 3 I-FABP和MELD评分预测SBP的ROC曲线比较 Figure 3 Comparison of ROC curves of I-FABP and MELD scores for predicting SBP |
随访期间累计死亡患者29例，其中3个月、6个月、9个月和1年的病死率分别为4.6%(6例)、13.7%(18例)、19.8%(26例)、22.1%(29例)。在发生细菌感染的45例患者中，有20例(44.4%)在观察期内死亡，而86例未发生感染的患者中有9例(10.5%)死亡，两组患者的病死率比较，差异有统计学意义(P＜0.001)。相较于生存者，死亡患者的I-FABP显著升高，其中3个月死亡患者[2.41(1.82, 3.42) VS 1.46(0.85, 2.33)]，6个月死亡患者[2.12(1.46, 3.25) VS 1.38(0.83, 2.28)]，9个月死亡患者[2.41(1.52, 3.25) VS 1.21(0.79, 2.07)]，12个月死亡患者[2.32(1.50, 3.21) VS 1.21(0.79, 2.07)]的I-FABP中位数与其他患者比较，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。
多因素Cox回归分析肝硬化患者不良预后的预测因素，采用向前逐步回归法对HR值调整后，显示I-FABP仅与9个月、12个月病死率相关。如表 3所示。
| 表 3 多因素Cox回归分析不同时间死亡的预测因素 Table 3 Multivariate Cox regression analysis on the predictive factors for death at different times |
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Kaplan-Meier曲线分析显示，I-FABP四分位数组间总病死率比较，差异有统计学意义(P=0.003)，I-FABP水平较低患者的1年内病死率较低(q1：4.3%)，反之则显著升高(q2：22.6%；q3：33.3%；q4：45.0%)。此外，I-FABP四分位数组间无感染患者病死率比较，差异无统计学意义(P=0.394)，如图 4所示。
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| 注：A为累积总病死率；B为未感染组累积病死率。 图 4 根据I-FABP四分位数分层的所有患者12个月病死率Kaplan-Meier曲线图 Figure 4 Kaplan-Meier curve of 12-month mortality of all patients according to I-FABP quartile stratification |
采用td-ROC曲线分析预测因素对不同时间点肝硬化相关死亡的预测效能。整体而言，MELD评分的AUC略大于I-FABP，但差异无统计学意义(均P＞0.05)，但二者的联合模型对病死率有较高的预测效能。如表 4和图 5所示。
| 表 4 研究参数对生存结局的预测性能比较 Table 4 Comparison of the predictive efficacy of studied variables for survival outcome |
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| 图 5 时间依赖性AUC分析评估MELD和I-FABP对生存结局的预测效能 Figure 5 Time-dependent AUC analysis to evaluate the predictive efficacy of MELD and I-FABP for survival outcome |
本研究主要评估I-FABP与肝硬化细菌感染风险和生存预后之间的关联，随访时间为12个月，有3个主要发现。首先，I-FABP与基线炎症参数及肝病严重程度相关；其次，I-FABP是肝硬化相关SBP的预测因子；最后，I-FABP是长期生存的独立预测因子。
研究[9]报道I-FABP储存在肠上皮细胞内，在肠细胞损伤或死亡时，释放到细胞外空间。较高的循环I-FABP水平与门静脉高压程度相关[10]。本研究中，I-FABP与肝功能指标PT-INR和ALB相关，提示肠细胞死亡和肝脏合成功能障碍之间存在关联。Child-Pugh分级和MELD评分是临床常用的评估肝功能障碍和预后的量化指标，本研究血清I-FABP水平随Child-Pugh分级和MELD评分增加而持续升高，进一步支持肠道屏障功能受损与疾病严重程度相关。多变量Cox回归分析中，I-FABP是肝脏相关死亡的独立预测因素，且I-FABP四分位数显示出良好的区分患者预后(良好、中等及不良)的能力。此外，td-ROC曲线表明，相较于MELD评分，I-FABP对生存预后无明显优势，但两者联合模型具有较高的预测价值。
肝硬化住院患者中25%~47%被诊断细菌感染，并伴有较高的病死率和较长的住院时间[2, 11]，给患者家庭和社会带来沉重的经济负担[12]。本研究随访期间有45例(34.4%)患者因细菌感染累积住院71次，平均住院持续时间15 d，腹腔感染是最常见的感染类型，这与门静脉高压及肠道黏膜通透性增加使肠道微生物通过肠-肝轴进入腹腔有关[4-5, 13]。另外，基线I-FABP与炎症参数IL-6相关，支持肠道屏障破坏与肝脏炎症之间的潜在关联。研究[14-15]报道肠道衍生PAMP激活肝内常驻巨噬细胞和浸润的活化单核细胞，影响纤维化进展及生存预后。细菌感染已被证明是肝硬化急性失代偿和预后不良的重要危险因素[2, 16]。本研究多因素分析显示I-FABP可预测新发SBP，且I-FABP四分位数对随访期间细菌感染和SBP累积发生率显示出良好的区分能力。
综上所述，肠细胞损伤标志物I-FABP过度表达及其与肝功能障碍和炎症的关系，反映肠道屏障功能障碍对肝功能的不利影响，本研究结果证实I-FABP是肝硬化相关SBP和长期生存的预测指标，并提示维持肠道屏障功能可能是阻断慢性肝病患者炎症和纤维化进展的潜在治疗靶点。
作者贡献声明：韩才均负责课题设计、资料分析、撰写论文，吴政燮、黄媛、金星参与收集数据、拟定写作思路及修改论文，朴美花参与修改论文及最后定稿。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。
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