2. 青海省第四人民医院呼吸一科, 青海 西宁 810007
2. Respiratory Department I, the 4th People's Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, China
维生素D是一种脂溶性维生素，参与维持人体正常生理功能，其活性形式1, 25-二羟维生素D[1, 25(OH)2D]和25-羟基维生素D[25(OH)D]可以调节机体免疫反应，也在宿主抵抗结核分枝杆菌感染的过程中起重要调节作用。维生素D缺乏被认为与免疫力受损和结核病风险增大有关，这使人们关注到低水平维生素D可能促进结核病发展[1]。结核病患者维生素D水平低于健康人，补充维生素D可改善临床疗效[2]。Ma等[3]证实1, 25-二羟维生素D3[1, 25(OH)2D3]具有抗炎和抗细胞增殖作用。维生素D水平充足(＞30 ng/mL)可为其代谢提供充足的底物，而维生素D水平不足(＜20 ng/mL)则会削弱底物的可用性，从而影响巨噬细胞启动对结核分枝杆菌的先天免疫反应[4]。CYP2R1基因位于11号染色体p15.2区，包含5个外显子，并编码由肝微粒体产生的、包含501个氨基酸的维生素D 25-羟化酶[5]。该酶促进维生素D在肝脏的羟基化，使维生素D转化为25(OH)D，是维生素D代谢的重要部分[6]。CYP2R1基因位点的多态性影响维生素D在体内的代谢，与维生素D缺乏具有相关性[7]。前期研究[8]发现，结核病患者血清维生素D水平往往较低。本研究采用病例对照研究的方法，从CYP2R1单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)角度探讨其与青海地区结核病患者维生素D水平和结核病易感性的关系。
1 对象与方法 1.1 研究对象选择2020年5月—2021年12月在青海省某医院接受治疗的174例肺结核患者为病例组，其中男性80例，女性94例，平均年龄45.45岁。所有病例均符合《肺结核诊断标准(WS 288—2017)》[9]。选取该院同期体检的202例与病例组年龄、性别相匹配的非结核患者为对照组，其中男性105例，女性97例，平均年龄43.74岁。对照组均无结核病临床症状和体征、无结核病史。结核组和对照组研究对象的一般情况比较，差异无统计学意义(均P>0.05)，见表 1。所有结核病患者和体检健康者都签署知情同意书。
| 表 1 两组患者一般人口学特征 Table 1 General demographic characteristics of two groups of patients |
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采集晨起受试者空腹静脉血2 mL于EDTA-K2抗凝管中，采集后2 h内以5 000 r/min离心10 min，分别提取血细胞和血浆。从血细胞中提取DNA，贮存于-80℃冰箱待检。DNA提取方法参照天根公司提供的DNA提取说明书。
1.2.2 引物设计与合成通过NCBI查找CYP2R1基因的rs10741657、rs10766197、rs1993116位点的引物序列，根据引物设计原则，利用NCBI的primerblast在线引物设计功能设计rs10766197、rs1993116位点的引物序列。rs10741657位点的引物序列参考文献[10]。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列见表 2。
| 表 2 CYP2R1 SNPs引物序列 Table 2 Primer sequences of CYP2R1 SNPs |
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建立30 μL的PCR反应体系：DNA 1 μL，2×Taq Plus PCR Master Mix 15 μL，ddH2O 13 μL，10 μmol/L的上、下游引物各0.5 μL。循环参数为：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，35个循环；终延伸72℃ 5 min。其中，rs1993116位点的退火温度为59℃，其余条件不变。扩增产物经1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测, 通过凝胶成像分析仪观察扩增结果。
1.2.4 基因测序与遗传模型生工生物工程上海(股份)有限公司对PCR产物纯化并测序, 通过Chromas软件对测序结果比对分析。由于未知CYP2R1各位点基因型在不同遗传模型下对表型的控制特征，本研究从以下三种遗传模型对CYP2R1各位点多态性与结核病易感性的相关性进行分析：rs10741657和rs1993116位点中，AA表示野生型基因型，AG表示杂合型基因型，GG表示突变型基因型。显性模型为AA VS (AG+GG)；隐性模型为GG VS (AG+AA)；超显性模型为AG VS (GG+AA)。rs10766197位点中，GG表示野生型基因型，AG表示杂合型基因型，AA表示纯合型基因型。显性模型为GG VS (AG+AA)；隐性模型为AA VS(AG+GG)；超显性模型为AG VS (GG+AA)[11]。
1.2.5 维生素D水平的测定采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清维生素D水平。血浆中加入标准品或样品和生物素抗体工作液均50 μL，洗涤后加入酶结合物工作液100 μL，再次洗涤后加入底物溶液显色，HBS-1096酶标分析仪测量OD值，通过标准曲线计算样本维生素D浓度。试剂盒(E-EL-0012c)购自武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司。
1.3 统计分析应用SPSS 19.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用方差分析，病例组和对照组间的基因型分布频率的比较采用χ2检验。Hardy-Weinberg(H-W)平衡检验判断样本是否具有群体代表性，以α=0.05为检验水准，若P>0.05，则认为基因型频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定理。
2 结果 2.1 CYP2R1基因各位点扩增产物检测结果CYP2R1基因rs10741657、rs10766197、rs1993116位点PCR扩增目的基因的大小分别为288、300、357 bp，见图 1。
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| 注：A为rs10741657位点；B为rs10766197位点；C为rs1993116位点。 图 1 CYP2R1各位点PCR产物电泳 Figure 1 Gel electrophoresis of PCR products at each locus of CYP2R1 gene |
测序结果显示出单、双峰两种测序峰图，单峰表示纯合基因型，双峰表示杂合基因型。各位点不同基因型测序图谱见图 2。
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| 注：A为rs10741657位点，B为rs10766197位点，C为rs1993116位点。在测序图谱中，突变位点用箭头标出，绿色峰表示碱基A，蓝色峰表示碱基C，黑色峰表示碱基G，红色峰表示碱基T。 图 2 CYP2R1基因各位点测序峰图 Figure 2 Peak sequencing chromatogram of each locus in CYP2R1 gene |
对照组人群在rs10741657、rs1993116、rs10766197位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，样本具有总体代表性，见表 3。
| 表 3 CYP2R1基因Hardy-Weinberg平衡检验 Table 3 Hardy-Weinberg equilibrium test for CYP2R1 gene |
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等位基因和基因型分布的统计分析结果显示，rs10741657、rs1993116、rs10766197等位基因的分布频率两组比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；rs10741657基因型频率在两组间分布差异具有统计学意义(P=0.032)，rs10766197(P=0.631)、rs1993116(P=0.104)基因型频率在两组间的分布比较，差异均无统计学意义，见表 4。
| 表 4 CYP2R1基因型和等位基因在两组间的分布[例(%)] Table 4 Distribution of CYP2R1 genotypes and alleles between two groups (No. of cases[%]) |
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rs10741657基因的隐性模型中，GG和(AG+AA)基因型频率在病例组和对照组之间比较，差异有统计学意义[OR=1.765，95%CI: (1.143~2.703)，P=0.010]，GG基因型在结核病患者中占比更高。在超显性模型中，AG与(GG+AA)基因型频率两组间比较，差异有统计学意义[OR=0.634, 95%CI: (0.421~0.953)，P=0.028]，AG基因型在对照组中的分布频率相对肺结核患者高。rs1993116、rs10766197的基因模型两组间分布比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)。见表 5。
| 表 5 病例组和对照组CYP2R1基因模型分布情况[例(%)] Table 5 Distribution of CYP2R1 gene models in the case group and control group (No. of cases[%]) |
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在rs10741657基因型中，病例组AA和AG基因型携带者的维生素D水平高于GG基因型，差异均有统计学意义(均P＜0.05)。在rs10766197、rs1993116基因型中，病例组和对照组基因型之间的维生素D水平比较，差异均无统计学意义(均P＞0.05)。见表 6。
| 表 6 结核病患者维生素D水平在CYP2R1不同基因型间的比较(μg/mL) Table 6 Comparison of vitamin D levels among different genotypes of CYP2R1 in patients with tuberculosis (μg/mL) |
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CYP2R1基因位于11号染色体11p15.2，包含5个外显子，其编码的维生素D25-羟化酶催化维生素D发生羟基化，转变为25(OH)D[5-6]。Wjst等[12]证实CYP2R1基因与25(OH)D浓度有关。对人体维生素D水平重要易感因素的全基因组关联研究[13]表明，CYP2R1基因与血清维生素D水平的变化相关，基因突变可分别导致维生素D运输、羟基化和胆固醇合成等途径发生障碍。在高加索人和亚洲人群中的研究[14]也得到相同的结论。维生素D严重缺乏(≤20 nmol/L)在结核病患者中常见，与结核病易感性独立相关[1]。Meta分析[15]显示，结核病患者的维生素D水平明显低于健康对照组，维生素D缺乏症(vitamin D deficiency，VDD)与结核病风险增加有关。韩国人群结核病患者中有71.7%的结核病患者同时被诊断为维生素D缺乏(< 20 ng/mL)[16]。CYP2R1基因rs1993116、rs10741657、rs2060793位点多态性可能与结核病易感性有关[17-18]。鉴于结核病患者体内维生素D水平低下，结合维生素D的代谢过程，本文研究了维生素D代谢酶CYP2R1基因的rs10741657、rs10766197、rs1993116位点与青海地区结核病患者遗传易感性的关系，并讨论了CYP2R1基因突变对人群维生素D水平的影响。
本研究发现，CYP2R1基因的rs10741657位点多态性与结核病之间存在相关性(P=0.032)，结核病患者中，rs10741657位点GG基因型携带者体内维生素D水平低于AA基因型(P=0.033)和AG基因型(P=0.034)，推测rs10741657基因多态性与维生素D水平和结核病的发病相关。rs10741657基因模型分布的频率显示，在显性模型中，GG基因型是肺结核的危险因素[OR=1.765，95%CI：(1.143~2.703)，P=0.010]；在超显性模型中，AG基因型是肺结核的保护因素[OR=0.634，95%CI：(0.421~0.953)，P=0.028]。
肺结核与维生素D水平降低也存在相关性，维生素D缺乏可能是结核病的危险因素之一[8]。本研究显示，结核病患者rs10741657基因多态性与人体内维生素D水平相关，GG基因型携带者体内维生素D水平低于AA和AG基因型(均P < 0.05)。对丹麦和约旦人群的研究[19-20]发现，rs10741657位点AG和AA基因型与高维生素D水平相关(均P < 0.05)，GG基因型与维生素D缺乏症的风险增加相关。Harishankar等[18]也获得相同的结论。然而，针对维吾尔族人群的研究[21]与本研究结果不同，显示CYP2R1基因的rs10766197(A/G)位点与维生素D水平缺乏相关性，这可能与遗传背景和环境因素有关。
综上所述，青海地区结核病患者rs10741657基因多态性与维生素D水平相关，该位点的突变很可能预示患者维生素D水平缺乏。GG基因型可能会增加结核病的风险，rs10766197、rs1993116多态性与结核病和维生素D水平之间缺乏关联，这些基因位点在维生素D相关的结核病发病机制中的作用尚不清楚。本研究未收集平原地区的样本，且未对不同民族之间进行分层分析，因此需要扩大样本范围，通过进一步研究验证CYP2R1基因突变与青海地区结核病患者维生素D水平和结核病易感性的相关性。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。
| [1] |
Junaid K, Rehman A, Jolliffe DA, et al. Vitamin D deficiency associates with susceptibility to tuberculosis in Pakistan, but polymorphisms in VDR, DBP and CYP2R1 do not[J]. BMC Pulm Med, 2016, 16(1): 73. DOI:10.1186/s12890-016-0240-2 |
| [2] |
Sutaria N, Liu CT, Chen TC. Vitamin D status, receptor gene polymorphisms, and supplementation on tuberculosis: a systematic review of case-control studies and randomized controlled trials[J]. J Clin Transl Endocrinol, 2014, 1(4): 151-160. |
| [3] |
Ma D, Zhang RN, Wen Y, et al. 1, 25(OH)2D3-induced interaction of vitamin D receptor with p50 subunit of NF-κB suppresses the interaction between KLF5 and p50, contributing to inhibition of LPS-induced macrophage proliferation[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017, 482(2): 366-374. DOI:10.1016/j.bbrc.2016.11.069 |
| [4] |
Maruthai K, Sankar S, Subramanian M. Methylation status of VDR gene and its association with vitamin D status and VDR gene expression in pediatric tuberculosis disease[J]. Immunol Invest, 2022, 51(1): 73-87. DOI:10.1080/08820139.2020.1810702 |
| [5] |
毛媛媛. 宁夏回族绝经后女性GC、CYP2R1基因多态性与血清维生素D水平的关系[D]. 银川: 宁夏医科大学, 2017. Mao YY. Correlation between GC、CYP2R1 genetic polymorphism and 25-hydroxyvitamin D in Ningxia Hui postmeno-pousal women[D]. Yinchuan: Ningxia Medical University, 2017. |
| [6] |
Jones G, Strugnell SA, DeLuca HF. Current understanding of the molecular actions of vitamin D[J]. Physiol Rev, 1998, 78(4): 1193-1231. DOI:10.1152/physrev.1998.78.4.1193 |
| [7] |
Hussein AG, Mohamed RH, Alghobashy AA. Synergism of CYP2R1 and CYP27B1 polymorphisms and susceptibility to type 1 diabetes in Egyptian children[J]. Cell Immunol, 2012, 279(1): 42-45. DOI:10.1016/j.cellimm.2012.08.006 |
| [8] |
李咏雪, 王兆芬, 王玉清, 等. 青海省肺结核与维生素D关系的分析[J]. 中华传染病杂志, 2021, 39(9): 524-527. Li YX, Wang ZF, Wang YQ, et al. Analysis on the relationship between pulmonary tuberculosis and vitamin D in Qinghai Province[J]. Chinese Journal of Infectious Diseases, 2021, 39(9): 524-527. DOI:10.3760/cma.j.cn311365-20201109-00841 |
| [9] |
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 肺结核诊断标准(WS 288-2017)[J]. 新发传染病电子杂志, 2018, 3(1): 59-61. National Health and Family Planning Commission of the People's Republic of China. Diagnostic criteria for tuberculosis (WS 288-2017)[J]. Electronic Journal of Emerging Infectious Diseases, 2018, 3(1): 59-61. DOI:10.3877/j.issn.2096-2738.2018.01.017 |
| [10] |
Barooah P, Saikia S, Bharadwaj R, et al. Role of VDR, GC, and CYP2R1 polymorphisms in the development of hepatocellular carcinoma in hepatitis C virus-infected patients[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2019, 23(5): 325-331. DOI:10.1089/gtmb.2018.0170 |
| [11] |
Lewis CM, Knight J. Introduction to genetic association stu-dies[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2012, 2012(3): 297-306. |
| [12] |
Wjst M, Altmüller J, Faus-Kessler T, et al. Asthma families show transmission disequilibrium of gene variants in the vitamin D metabolism and signalling pathway[J]. Respir Res, 2006, 7(1): 60. DOI:10.1186/1465-9921-7-60 |
| [13] |
Wang TJ, Zhang F, Richards JB, et al. Common genetic determinants of vitamin D insufficiency: a genome-wide association study[J]. Lancet, 2010, 376(9736): 180-188. DOI:10.1016/S0140-6736(10)60588-0 |
| [14] |
Duan LZ, Xue ZG, Ji HW, et al. Effects of CYP2R1 gene variants on vitamin D levels and status: a systematic review and Meta-analysis[J]. Gene, 2018, 678: 361-369. DOI:10.1016/j.gene.2018.08.056 |
| [15] |
Huang SJ, Wang XH, Liu ZD, et al. Vitamin D deficiency and the risk of tuberculosis: a Meta-analysis[J]. Drug Des Devel Ther, 2017, 11: 91-102. |
| [16] |
Joo MH, Han MA, Park SM, et al. Vitamin D deficiency among adults with history of pulmonary tuberculosis in Korea based on a nationwide survey[J]. Int J Environ Res Public Health, 2017, 14(4): 399. DOI:10.3390/ijerph14040399 |
| [17] |
林霏申, 郭晶, 高卫卫, 等. 南京地区维生素D代谢酶CYP2R1基因多态性与结核易感性的关系[J]. 中华生物医学工程杂志, 2018, 24(2): 111-115. Lin FS, Guo J, Gao WW, et al. Association between gene polymorphism of vitamin D metabolic enzyme CYP2R1 and susceptibility to tuberculosis in Nanjing[J]. Chinese Journal of Biomedical Engineering, 2018, 24(2): 111-115. DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-1927.2018.02.007 |
| [18] |
Harishankar M, Sampath P, Sriram M, et al. Association of CYP2R1 gene polymorphisms in pulmonary tuberculosis[J]. Meta Gene, 2021, 28: 100875. DOI:10.1016/j.mgene.2021.100875 |
| [19] |
Lafi ZM, Irshaid YM, El-Khateeb M, et al. Association of rs7041 and rs4588 polymorphisms of the vitamin D binding protein and the rs10741657 polymorphism of CYP2R1 with vitamin D status among Jordanian patients[J]. Genet Test Mol Biomarkers, 2015, 19(11): 629-636. DOI:10.1089/gtmb.2015.0058 |
| [20] |
Nissen J, Rasmussen LB, Ravn-Haren G, et al. Common variants in CYP2R1 and GC genes predict vitamin D concentrations in healthy Danish children and adults[J]. PLoS One, 2014, 9(2): e89907. DOI:10.1371/journal.pone.0089907 |
| [21] |
Xu XJ, Mao JF, Zhang MC, et al. Vitamin D deficiency in Uygurs and Kazaks is associated with polymorphisms in CYP2R1 and DHCR7/NADSYN1 genes[J]. Med Sci Monit, 2015, 21: 1960-1968. DOI:10.12659/MSM.894793 |