耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae, CRKP)因其高耐药性、高传播性和高病死率已对临床抗感染治疗构成了严峻挑战^[1]。在应对CRKP感染的治疗药物中，多黏菌素、替加环素在疗效和安全性方面存在使用限制，因此头孢他啶/阿维巴坦(ceftazidime/avibactam, CZA)已成为CRKP感染治疗的较优选择^[2]。CZA是我国于2019年被批准用于临床治疗的一种新型复合制剂^[3]，对多重耐药革兰阴性杆菌引起的复杂性腹腔内感染、复杂性泌尿系统感染，以及医院获得性肺炎有较好的疗效，是目前治疗产KPC、AmpC等非金属酶CRKP感染的主要药物之一，但其抗菌谱不覆盖产NDM、IMP等金属酶的CRKP^[4-5]。随着CZA的广泛应用已出现了较多耐药病例的报道，而且呈上升趋势^[6]。CZA耐药CRKP的出现进一步提升了临床耐碳青霉烯类肠杆菌目细菌(CRE)感染治疗的难度，目前其耐药机制以及相关流行病学数据较为缺乏。为此，本研究就徐州医科大学附属医院2021年1月—2023年9月CZA耐药CRKP的流行病学特征、耐药机制进行分析，以延缓CZA耐药，为临床抗感染精准治疗提供实验室依据。

1.   材料与方法

1.1   菌株来源

试验纳入菌株为徐州医科大学附属医院2021年1月—2023年9月临床各科室分离的不重复CZA耐药CRKP菌株(对亚胺培南或美罗培南任一耐药)。试验对照菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705由南通大学附属医院许波银老师赠送。本研究获该院伦理委员会批准(审批号XYFY2022-KL008-01)。

1.2   仪器与试剂

MALDI-TOF MS(德国布鲁克)，VITEK 2 Compact及药敏卡AST-N335(法国梅里埃)，聚合酶链式反应(PCR)仪(美国BIO-RAD)，CZA药敏纸片(意大利Liofilchem)，DNA Marker、PCR引物、Agarose N、GelRed核酸染料、SGExcel FastSYBR Master预混液(上海生工生物公司)，碳青霉烯酶胶体金试剂盒(丹娜生物科技)，TRIzol试剂(上海李记生物公司)，磁珠法细菌DNA提取试剂盒D6361-02(广州美基生物科技)，逆转录试剂盒(武汉塞维尔公司)。

1.3   方法

1.3.1   菌株鉴定及药物敏感试验

将血平板上分离的单个纯菌落采用质谱仪复核菌种，VITEK 2 Compact进行药物敏感试验，药物敏感折点判读参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)^[7]标准，替加环素药敏折点判读参照美国食品药品监督局(FDA)^[8]标准，CZA采用纸片扩散法检测，抑菌圈直径≤20 mm为耐药。

1.3.2   临床资料的收集

使用电子病历系统病例查阅栏收集3例产KPC酶的肺炎克雷伯菌(KPC-KP)感染患者的诊断、治疗和转归资料。

1.3.3   碳青霉烯酶基因的检测

(1) 胶体金法：将73株CZA耐药CRKP培养获得纯菌落，在每个EP管中加入300 μL裂解液，挑取纯菌落置于裂解液中，漩涡震荡10 s使细菌在裂解液中充分混匀后静置10 min，吸取200 μL于免疫层析试纸的两个加样孔，等待15 min观察结果^[9]。(2)PCR法：煮沸法提取73株CZA耐药的CRKP基因组，采用PCR及凝胶电泳，双向测序检测5种最常见的碳青霉烯酶基因，引物由生工生物南京分公司合成，引物设计及反应体系设置见参考文献[10]方法，引物参数见表 1。将扩增产物提交上海生工生物公司测序，采用Snapgene将序列与GeneBank中下载的模板基因比对分析。

1.3.4   全基因组测序

使用磁珠法提取KPC突变菌株的基因组DNA，寄送至上海生工生物公司完成全基因组测序及序列拼接，在proksee网站(https://proksee.ca/)进行全基因组序列分析。提取KPC突变菌株7个管家基因序列，在相关网站完成多位点序列分型(MLST，https://cge.food.dtu.dk/services/MLST/)。

1.3.5   bla_KPC相对拷贝数的检测

采用煮沸法提取3株KPC-KP的DNA，以肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705为对照菌株，采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)法检测bla_KPC拷贝数，引物序列及参数见表 2。反应体系配置为：2×SGExcel FastSYBR Mixture 10 μL，前后引物各0.4 μL，DNA模板1 μL，无菌无酶水8.2 μL。反应参数设置为：95℃ 5 min；95℃ 5 s，56℃ 10 s，72℃ 10 s，循环40次；内部参照基因为管家基因rpoB，采用2^-ΔΔCT公式计算相对拷贝数，所有菌株DNA提取3次，qPCR设置3个复孔。

1.3.6   bla_KPC相对表达量的检测

采用TRIzol法提取KPC-KP RNA(1×10⁸个细菌溶解于1 mL TRIzol)，逆转录试剂盒法获得其cDNA后，采用RT-qPCR法进行相对表达量检测。对照菌株、内部参照基因、RT-qPCR引物、反应参数同1.3.5。采用2^-ΔΔCT公式计算相对表达量，所有菌株RNA提取3次，qPCR设置3个复孔。

1.4   统计学处理

RT-qPCR数据采用Welch’s t-test(双尾)进行统计学分析，计量资料用中位数(四分位数)[M(P₂₅，P₇₅)]表示，P≤0.05为差异具有统计学意义。

2.   结果

2.1   菌株特征及分布

73株CZA耐药CRKP分离患者中，男性占比61.64%，年龄为63(32，74)岁；17株分离自年龄＜1岁的患者，40株分离自＞60岁的患者。菌株主要来源于痰(69.86%)、导管(10.96%) 及尿(6.85%)标本，主要分离自各科室重症监护病房(ICU，67.12%)、神经外科病房(21.92%)及血液内科病房(2.74%)。见表 3。

2.2   药敏试验结果

药敏试验结果显示，73株CZA耐药CRKP对多数抗菌药具有耐药性，尤其对头孢菌素类及青霉素类抗生素耐药率已达100%，对氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、磺胺类及单环β-内酰胺类药物氨曲南的耐药率稍低，但也超过60%，仅发现1株CRKP对多黏菌素耐药，所有CRKP对替加环素均敏感，见表 4。17株对氨曲南敏感的CRKP均来源于新生儿ICU。

表  4  73株CZA耐药CRKP对17种抗菌药物的耐药情况

Table  4  Resistance of 73 CZA-resistant CRKP strains to 17 antimicrobial agents

抗菌药物	耐药株数	耐药率(%)
哌拉西林/他唑巴坦	73	100
替卡西林/克拉维酸	73	100
头孢吡肟	73	100
头孢他啶	73	100
头孢哌酮/舒巴坦	73	100
氨曲南	56	76.71
亚胺培南	72	98.63
美罗培南	73	100
阿米卡星	45	61.64
妥布霉素	51	69.86
米诺环素	47	64.38
多西环素	55	75.34
替加环素	0	0
左氧氟沙星	52	71.23
环丙沙星	61	83.56
复方磺胺甲唑	52	71.23
多黏菌素	1	1.37

2.3   碳青霉烯酶基因型检测结果

碳青霉烯酶基因型胶体金法检测结果显示，73株耐CZA的CRKP中，37株同时产KPC和NDM，33株单产NDM株，3株单产KPC。碳青霉烯酶基因型PCR结合双向测序与胶体金方法结果一致率为100%。见表 5。KPC与NDM联产菌株PCR产物电泳及胶体金检测结果见图 1。

图  1  1株KPC与NDM联产菌株PCR产物电泳及胶体金检测图谱

注：M为DNA marker；-为阴性对照；+为bla_KPC阳性对照；1为bla_KPC；2为bla_NDM；3为bla_OXA；4为bla_IMP；5为bla_VIM。

Fig.  1  Electrophoresis and colloidal gold plots of 1 KPC and NDM co-producing strain

下载: 全尺寸图片

2.4   KPC突变菌株全基因组测序结果

对73株CZA耐药CRKP菌株进行Sanger测序后，发现1株bla_KPC-2突变株KP-2842，基因组测序结果显示为ST11型，在bla_KPC-2的532发生碱基突变(G532T)，导致在KPC-2酶第179位的氨基酸天冬氨酸被酪氨酸取代(D179Y)，经比对与bla_KPC-33序列一致。

2.5   KPC-KP bla_KPC相对拷贝数及表达量

共检出3株KPC-KP(KP-2127、KP-2189、KP-2842)菌株，与对照菌株肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705相比，bla_KPC相对拷贝量分别上调至2.04、2.21、4.86倍，相对表达量分别增加至12.67、7.66、13.93倍。见图 2。

图  2  CZA耐药CRKP的bla_KPC拷贝及表达水平

注：KP-2842检测基因为bla_KPC-33。

Fig.  2  Copy number and expression level of bla_KPC in CZA-resistant CRKP

下载: 全尺寸图片

2.6   3株KPC-KP感染患者治疗与转归

KP-2127感染患者，32岁，男性，因前交通动脉瘤破裂伴蛛网膜下腔出血入住神经外科ICU，住院第24天痰培养检出CZA耐药CRKP，经呼吸内科会诊后改为多黏菌素静脉滴注及雾化吸入治疗，第39天患者病情好转转入社区医院继续康复治疗。KP-2189感染患者，77岁，女性，因小脑出血破入脑室入住神经外科病房，住院期间因肺部感染使用注射用磷酸阿米卡星治疗14 d，治疗第13天痰培养检出CZA耐药CRKP，患者家属要求转院治疗。KP-2842感染患者，62岁，女性，因多发性颅内动脉瘤破裂伴蛛网膜下腔出血入住神经外科，住院第6天痰培养检出碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯(CSKP)，住院第24天痰培养检出CZA敏感CRKP，期间使用注射用头孢尼西钠、头孢他啶、左氧氟沙星等多种药物，住院第29天痰培养检出CZA耐药CRKP，改用替加环素治疗7 d后痰培养仍显示该病原菌未被清除，转入社区医院继续治疗。

3.   讨论

本文对临床标本分离的73株CZA耐药CRKP的标本来源、耐药性及耐药机制进行研究，发现分离自年龄＜1岁和＞60岁的患者占比最高，此与这类患者抵抗力较弱、感染风险高有关，菌株分离自痰标本占比最高，达69.86%，与相关研究^[11-12]结果一致，提示呼吸道标本是CZA耐药CRKP的主要来源，加强呼吸道卫生的管理或可一定程度预防CZA耐药CRKP感染。本研究发现CZA耐药CRK感染病例多来源于ICU，一方面与入住该科的患者免疫力低下，常接受侵入性操作及应用多种抗菌药物有关。既往研究^[13]表明，入住ICU是感染CRKP的危险因素之一；另一方面因CRKP可移动元件常能介导耐药基因水平传播，导致该类耐药菌常可以在医疗机构内，尤其是ICU内传播流行。因此，医院应将ICU作为感染防控的重点科室。

对临床分离的CRKP菌株进行准确、快速的酶型检测可减少临床经验性广谱抗菌药物的不合理使用。目前实验室检测碳青霉烯酶的手段多样，包括mCIM-eCIM联合试验、APB-EDTA试验、Carba NP试验等表型检测方法，以及本试验采用的测序和胶体金基因型检测方法。本研究胶体金方法和测序结果呈现出高度一致性，而且覆盖了联产酶和KPC突变体KPC-33酶，同时灵敏度及准确性也良好，无需特殊的设备，操作简单快速便于推广，可指导临床医生根据碳青霉烯酶型选择治疗方案。

据中国细菌耐药监测网(CHINET)^[14]监测数据，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药率已达20%以上。CRKP主要的耐药机制是产碳青霉烯酶，但所产酶型具有区域和人群分布差异^[15]。在我国，丝氨酸酶KPC和金属酶NDM的产生是其对碳青霉烯类耐药的首要原因，成人以KPC酶为主，儿童以NDM酶为主^[16]。CZA能有效抑制A、C类及部分D类β-内酰胺酶，但对B类金属酶无抑制作用^[17]。本研究73株CZA耐药CRKP中，有70株(95.89%)产NDM，表明产生金属酶是该院CRKP对CZA耐药的主要机制，与Chen等^[18]的研究结果相符。其中有37株联产NDM和KPC，这使得临床治疗难度更大，可选择的药物更加局限。因CZA无法水解金属酶NDM^[17]，其应用对产该酶的菌株有一定的筛选作用。来自欧洲的一项研究^[19]表明，在CZA投入使用后的筛选压力下，该医疗机构ICU内CRKP菌株碳青霉烯酶的优势酶型从丝氨酸酶KPC转变为金属酶VIM。因此，在抗菌药物应用之前准确、快速检测碳青霉烯酶基因型，对于临床CRKP感染的精准治疗和延缓耐药的产生是非常必要的。

不同碳青霉烯酶对抗菌药物的活性存在差异，当其产多种碳青霉烯酶时常呈现多药耐药、高水平耐药^[20]，因此使用单一药物治疗效果往往不佳，意味着这部分菌株的临床治疗更加困难，对其治疗需要联合用药或研发新的抗菌药物复合制剂。2013年巴西首次报道了1株KPC-NDM联产的霍氏肠杆菌，后又在印度等地区的肺炎克雷伯菌中检出^[21-22]，新型冠状病毒感染流行期间巴西曾报道同时携带这两种基因的CRKP引起的医院感染暴发^[23]，本研究发现的KPC与NDM联产菌株除1株外均为2021年新型冠状病毒感染流行期间检出，提示可能存在这种菌株的局部流行。Gao等^[20]研究表明，KPC-2与NDM-1联产菌株有较强的适应性和传播性，进化分析显示，可能是bla_KPC-2阳性CRKP获得了一个携带bla_NDM-1的质粒进化而来，并可稳定遗传，提示这种联产菌株是今后实验室和临床需要重点关注的耐药菌。

药敏试验结果显示，73株CZA耐药CRKP对头孢菌素类和青霉素类药物均耐药，对喹诺酮类左氧氟沙星、磺胺类复方磺胺甲唑、氨基糖苷类妥布霉素及四环素类米诺环素的耐药率稍低，但也均超过60%，说明CZA耐药CRKP引起的感染治疗可选择的抗菌药物非常受限。值得庆幸的是，CZA耐药菌株对多黏菌素和替加环素的耐药率仍处于较低水平，分别为1.37%、0，与以往研究^{[12, 24]}结果一致，提示这两种抗菌药物目前暂时仍可作为CZA耐药菌株感染治疗的有效选择之一。本研究发现仅产NDM-5的CRKP均显示出对氨曲南有较好的敏感性，17株对氨曲南敏感的CRKP均来源于新生儿ICU。对于氨曲南敏感CZA耐药的CRKP感染可选择氨曲南治疗，对于由NDM介导的CZA耐药CRKP感染，也可根据指南和临床研究使用氨曲南联合CZA治疗。CZA联合氨曲南对产NDM的CRKP可达到协同抑菌作用^[25-27]，复旦大学附属华山医院胡付品教授团队也曾报道CZA联合氨曲南和阿米卡星成功清除NDM-5阳性CRKP菌株引起血流感染的病例^[28]，揭示儿童感染CZA耐药CRKP时该方案或可作为黏菌素外的另一有效选择。本研究KP-2127感染患者使用药敏试验结果为敏感的多黏菌素治疗后好转出院，而KP-2842感染患者在替加环素50 mg q12h治疗第6天痰培养仍检出CZA耐药CRKP，专家共识表明替加环素在肺组织浓度较低，使用单药标准剂量疗效不佳，对于治疗CRE引起的重症医院获得性肺炎推荐使用大剂量替加环素方案联合用药，对于病情重的患者可延长疗程^[29]，因此对该患者的治疗需增加用药剂量、优化用药方案。

目前已知的CRKP对CZA的耐药机制还有基于KPC-2、KPC-3部分氨基酸的突变形成新的KPC亚型，如KPC-31、KPC-33等，除此之外还有野生型bla_KPC拷贝及表达增加合并膜通透性改变或者外排泵表达增加等^[30]。本研究发现1株KPC-KP为KPC-33突变体，该种突变体曾在我国北京^[31]、上海^[32-33]和河南^[34]等地区被检出，这是在江苏地区首次发现ST11型CRKP菌株携带bla_KPC-33，此外，还有2株对CZA耐药的KPC-KP经测序并未发现KPC-2的编码基因突变，RT-qPCR结果显示其bla_KPC-2相对拷贝数及表达量较肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705有不同程度上调，这可能是其出现CZA耐药的主要原因，是否合并产β-内酰胺酶(ESBLs)基因表达、膜孔通透性改变及外排上调等机制有待进一步研究。

本研究表明随着CZA的广泛使用，其耐药菌株在药物的选择压力下逐渐增加，产金属酶NDM是该院CRKP对CZA耐药的主要机制，其中KPC-2、NDM-1联产为最显著的特点，同时该院部分CRKP因bla_KPC-2突变或拷贝数上调导致其对CZA耐药，虽然本研究仅是一家单中心研究，无法代替整个地区的真实流行情况，但是这些数据仍应引起实验室和临床的足够重视，实验室应该积极提供碳青霉烯酶型检测，以便临床医生根据酶型结果进行精准治疗，双方密切配合以控制该耐药菌在医疗机构内传播与流行。