耳念珠菌(Candida auris)于2009年首次从日本一家医疗机构住院患者的外耳道中分离^[1]，被鉴定为一种新的子囊菌酵母物种，因此称为耳念珠菌。耳念珠菌与其他致病菌不同，一般不定植在黏膜表面和肠道，但能够在人类皮肤和无机物体表面存活较长时间，可定植于人体及医疗机构环境中，同时能够引起人类血液、中枢神经系统等局部或侵袭性感染^[2-3]。侵袭性耳念珠菌感染的病死率达29%~53%，其感染主要发生在危重症和免疫功能低下的患者中，如癌症患者、骨髓和器官移植患者。在世界卫生组织(WHO) 2022年发布的真菌优先病原体清单中，耳念珠菌被列为关键组(critical group)病原体之一^[4]。耳念珠菌对多种临床常用抗真菌药物耐药，并且部分菌株呈泛耐药，部分耳念珠菌分离株对三唑类药物(azoles)、棘白菌素类药物(echinocandins)和两性霉素B(amphotericin B, AmB)三类抗真菌药物均呈现耐药性，临床治疗困难。此外，耳念珠菌具有耐热性，对部分消毒剂呈现耐受^[5]。耳念珠菌无法通过常规检测方法准确鉴定，故存在将耳念珠菌误检为其他念珠菌的情况^[6-8]。这些因素均为耳念珠菌容易在医疗机构内出现大规模暴发的原因。

迄今为止，耳念珠菌已在全球范围内广泛流行，包括北美地区，以及英国、西班牙、意大利、德国等欧洲国家^[9-13]。截至2022年12月31日，美国疾病控制与预防中心(CDC)官网共报道了5 647例耳念珠菌临床病例。2016年首次报道耳念珠菌感染病例，此后病例数迅速增长。美国CDC开展耳念珠菌临床筛查，2016—2022年共筛查阳性病例13 167例，病例数呈现快速上升趋势^[14]。2020年美国CDC收集的分离株中，86%分离株对三唑类药物呈现耐药，26%分离株对两性霉素B呈现耐药；尽管2020年耳念珠菌对棘白菌素类药物耐药率较低(< 5%)，但2021年对棘白菌素类耐药和泛耐药菌株分离数量有所增加，且出现棘白菌素类耐药菌聚集事件^[15]。欧洲CDC曾对30个欧洲国家耳念珠菌流行情况进行分析，发现2013—2021年共15个国家报道了1 812例耳念珠菌病例。其中大部分病例考虑为定植(1 146例，63.2%)，血流感染、其他类型的感染分别为277例(15.3%)、186例(10.3%)，其余203例(11.2%)病例未进行感染或定植的分析^[16]。

中国2018年首次报道耳念珠菌分离株，此后耳念珠菌播散到10余个省份，虽然未发现大规模流行，但感染病例数呈快速上升趋势^[17-19]。因此，当前亟需加强对耳念珠菌耐药机制的研究，从而优化耳念珠菌诊治方案。目前，耳念珠菌相关的基础和临床研究已经广泛开展，耳念珠菌基因组学研究为人们了解其遗传结构和耐药性提供了独特的视角。

1.   耳念珠菌及其类群的基因组学研究

耳念珠菌是梅氏酵母科家族中克拉维斯波拉支系(Clavispora clade)中CTG类群的一员。CTG类群主要将CUG密码子翻译为丝氨酸，而不是亮氨酸^[20]。根据26S rDNA D1/D2区域、核糖体DNA内转录间隔子(internal transcribed spacer, ITS)区域序列分析，耳念珠菌新种被认为与梅氏酵母科(Metschnikowiaceae)类群中的鲁氏假丝酵母(Candida ruelliae)和希木龙念珠菌(Candida haemulonii)有密切的系统发育关系^[1]。希木龙念珠菌(Candida haemulonii)、亚希木龙念珠菌(Candida duobushaemulonii)和假希木龙念珠菌(Candida pseudohaemulonii)也都属于这一类群。比较耳念珠菌与上述三种菌的基因组发现，它们的基因组大小非常相似。耳念珠菌是一种七染色体酵母菌，基因组大小在12.1~12.7 Mb^[21]。耳念珠菌的种群中，电泳核型分析研究显示其基因组存在染色体数量和大小的变化。比较不同耳念珠菌类群的基因组，发现存在缺失、倒位和易位等结构变异现象^[22-23]。

目前，耳念珠菌分离株主要属于四个地理类群，按地点编号和命名分别为：南亚(Ⅰ)、东亚(Ⅱ)、非洲(Ⅲ)和南美(Ⅳ)。2018年伊朗发现了第五个新类群^[24]。基因组分析显示，Ⅰ~Ⅳ类群分离株可能源自过去360年内出现的一个共同祖先，而其中Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ类群分离株的共同祖先可以追溯到1980年代^[25]。除了上述五大地理类群以外，Suphavilai等^[26]在2023年通过全基因组测序提示可能存在Ⅵ类群。该研究发现的Ⅵ类群分离株与现有耳念珠菌类群基因差异超过36 000个单核苷酸多态性(SNP)，尽管与Ⅳ类群最为接近，但在交配型等位基因和染色体重排方面有着完全不同的特征。

耳念珠菌的不同类群之间存在显著的序列差异和基因内容差异。Ⅰ类群和Ⅲ类群分离株之间存在数百kb基因组倒位和易位^{[25, 27]}。耳念珠菌基因组可以迅速发生重排，特别是Ⅱ类群，通常对大多数抗真菌药物敏感，呈现不稳定性和端粒缩短的情况。耳念珠菌的亚端粒区域富集了细胞壁蛋白相关基因，这部分区域在Ⅱ类群分离株中相对其他类群大量缺失。此外，涉及L-鼠李糖(L-rhamnose)同化的基因簇的存在是Ⅲ类群和Ⅴ类群的独特特征^[23]。基因组内容的不同可能有助于解释不同类群分离株的表型差异。如与其他类群相比，Ⅱ类群分离株对破坏细胞壁的药物钙荧光白和刚果红高度敏感^[28]。此外，相对于Ⅰ类群、Ⅲ类群和Ⅳ类群，Ⅱ类群分离株显示出对消毒剂和紫外线更高的敏感性，导致细胞因子产生较少，并且甘露聚糖(mannans)更简单^{[24, 29-31]}。然而，Ⅰ类群分离株多重耐药分离株比例最高^[25]。Ⅱ类群分离株染色体重排对其毒力和耐药性的影响尚未完全确定，一些分离株可能导致真菌血症(fungemia)并呈现对三唑类耐药，可能引发严重的耐药菌感染^[32]。

2.   耳念珠菌耐药性相关基因组学研究

目前常见的抗真菌药物主要分为四类：三唑类药物、多烯类药物(polyenes)、棘白菌素类药物和氟胞嘧啶(flucytosine)^[33]。抗真菌药物的耐药机制考虑为膜转运蛋白、麦角固醇途径(ergosterol pathway)中的突变，以及细胞壁合成酶的突变^[34]。目前，耳念珠菌分离株对常用抗真菌药物，如三唑类、两性霉素B(多烯类)和棘白菌素类药物，都表现出较强的耐药性^[35]。鉴于具有遗传学联系的分离株存在不同抗性基因的等位基因，耳念珠菌的耐药性可能不是固有的，而是后天获得的^[36]。值得注意的是，基于群体基因组分析研究发现，与三唑类药物耐药性相关的类群特异性突变距今只有37年^[25]。

据报道，尽管不同类群之间的耐药水平差异很大，但超过90%的耳念珠菌分离株对氟康唑(三唑类药物)具有耐药性。氟康唑是目前使用最广泛的抗真菌药物，因其成本低、口服生物利用度高、抗菌谱广和安全性良好备受青睐。氟康唑通过抑制羊毛甾醇脱甲基酶(lanosterol demethylas, 由ERG11基因编码)从而抑制真菌细胞膜中麦角固醇的生物合成，这种抑制作用会导致Erg11底物羊毛甾醇增加和异常固醇中间体的产生。虽然在耳念珠菌中已经发现了许多类群特异性的三唑类耐药机制，但耐药机制仍未明确。既往研究^{[23, 25, 37-39]}分析，耳念珠菌中的三唑类耐药性通常源于染色体非整倍体引起的遗传多样性、染色体重排、靶酶突变、药物靶标过表达和有限的药物摄取/外流。然而在其他念珠菌物种中，氟康唑主要耐药机制涉及靶基因ERG11热点区域的点突变。Ⅰ类群和Ⅳ类群分离株中，最常见的点突变是Erg11Y132F和Erg11K143R上发生的替代(嘌呤核苷酸之间的转换)，Ⅲ类群分离株通常为Erg11F126L上发生的替代^[21]，Ⅱ类群分离株通常没有特定的ERG11突变^[32]。由于染色体非整倍体或染色体小区域的重复变异，导致的ERG11过表达在耳念珠菌三唑类耐药中发挥重要作用。相比于该片段只有一个拷贝的分离株，具有包含ERG11基因在内的1号染色体片段重复的分离株氟康唑的最低抑制浓度(MIC)明显更高^[25]。此外，耳念珠菌的5号染色体包括基因TAC1B、NCP1、ERG9和ERG13，其非整倍体能够快速获得氟康唑耐药性^[40]。由于药物外排泵转录调节因子TAC1B突变导致外排泵的转录上调, 是氟康唑高水平耐药性产生的重要原因；删除TAC1B则可以使耐药性消失^[41]。

两性霉素B作为多烯类抗真菌药物的重要成员，自20世纪50年代研制上市以来，一直是治疗隐球菌脑膜炎、黏霉菌病和许多双相真菌感染的一线选择^[42-45]。但耳念珠菌是临床上少数几种对两性霉素B耐药性高的真菌物种之一^[46-48]。最近的流行病学和转录研究表明，耳念珠菌对两性霉素B表现出高水平耐药性^{[21, 36, 49]}；在一个克隆群中，高达30%的耳念珠菌分离株表现出两性霉素B耐药^{[25, 49]}。白念珠菌(Candida albicans) 和光滑念珠菌(Candida glabrata)中两性霉素B耐药性的增加可能与麦角固醇生物合成途径(ergosterol biosynthetic pathway)的突变相关^[50-51]。多项研究发现，在两性霉素B耐药的耳念珠菌分离株中，麦角固醇途径受到调控，患者会在治疗过程中获得两性霉素B的耐药性^{[21, 52]}。然而，由于绝大多数耳念珠菌麦角固醇生物合成基因没有观察到突变，考虑可能存在其他两性霉素B相关的耐药机制。Rybak等^[53]研究发现，ERG6基因突变与耳念珠菌对两性霉素B的耐药性增加有关。Shivarathri等^[52]对两性霉素B耐药的耳念珠菌分离株进行转录分析显示，膜脂渗透性降低也可能是耐药性产生的原因。

棘白菌素类药物由于其安全性、便捷性、早期杀真菌活性，是治疗大多数念珠菌血症和侵袭性念珠菌感染的首选药物^[54]。棘白菌素类药物的耐药性通常与β-1, 3-葡聚糖合酶亚基基因FKS1和FKS2的热点区域发生突变有关，这些突变与动力学研究中动物感染模型的药物反应差以及临床治疗失败有关^[55-57]。β-葡聚糖是真菌细胞壁特有的核心多糖，其合成途径需要葡聚糖合成酶催化。棘白菌素类药物通过非竞争性抑制葡聚糖合成酶，阻止Fks1介导的β-葡聚糖在细胞壁中沉积，导致真菌细胞壁渗透性改变，细胞溶解死亡，从而杀灭真菌。但由于棘白菌素类药物可能作用于细胞膜的细胞外表面，目前尚不确定药物是否需要进入细胞内才能发挥抗真菌活性^[58-59]。在耳念珠菌中，导致Fks1氨基酸位点S639(S639F、S639P和S639Y)替换的突变是棘白菌素类药物耐药性的主要决定因素^{[25, 60-61]}。另外，一个双组分信号通路和高渗甘油1(Hog1)MAP激酶信号可能增加棘白菌素类药物的耐药性^[62]。Jenull等^[63]对棘白菌素类药物敏感与耐药的分离株的转录谱进行对比分析，发现与敏感耳念珠菌分离株相比，耐药分离株含有更高的甘露聚糖和葡聚糖，并表现出附着塑料能力的增强和对细胞壁干扰剂钙荧光白(calcofluor white)敏感性的差异。此外，耳念珠菌对棘白菌素类药物耐药似乎与抗性代价(fitness cost)有关，与敏感分离株相比，耐药分离株更容易被巨噬细胞吞噬^[64]。

耳念珠菌具有多药耐药性，目前导致其耐药的分子机制尚未研究清楚，基因组学技术的应用可以揭示部分耐药性产生的分子机制。棘白菌素类药物抗性的出现伴随着FKS1热点1中密码子缺失和FKS1中新的热点3中的替代。ERG3和CIS2的突变进一步增加了棘白菌素类药物的MIC值。与三唑类药物敏感性降低相关的因素包括转录因子TAC1b的突变、药物外排泵Cdr1的过度表达，以及一个含有ERG11的1号染色体区段重复和含有TAC1b的整个5号染色体的重复。这两个染色体重复与ERG11、TAC1b和CDR2的过表达相关，但与CDR1无关。ERG3和ERG11中出现的无义突变导致分离菌株对两性霉素B的敏感性降低，同时伴随着对氟康唑的交叉耐药。MEC3作为一个主要在DNA损伤稳态中起作用而闻名的基因，其突变进一步增加了多烯类药物的MIC值。总体而言，耳念珠菌多药耐药性具有丰富的多样性和突变潜力，即使在迄今未与多药耐药相关联的Ⅱ类群中也值得警惕^[65]。

3.   基因组学技术应对耳念珠菌的临床应用

基因组学技术可以帮助耳念珠菌分离株进行分型和溯源，同时可以判断病原菌传播来源，并采取有效的防控措施。McDougal等^[66]借助基因组学技术调查了在美国德克萨斯州一所最高安全级别监狱医院内发生的耳念珠菌聚集性病例。该调查在1例耳念珠菌血流感染病例出现后，对相关的344例患者进行筛查，发现9例阳性患者。对9例阳性患者的分离株进行全基因组测序分析，结果显示所有分离株均属于耳念珠菌Ⅲ类群，该类群与当地广泛传播的菌株有共性。基因组测序分析发现，监狱医院内最初感染患者的分离株与其他分离株之间最大的SNP差异仅为21个，说明这些分离株感染来源相同。研究人员据此判断该聚集病例发生在一个明确定义的空间和时间内，而非入狱前在社区获得，基于此结果医院加强感染控制措施，从而减缓了耳念珠菌感染的传播^[66]。

Hong等^[67]报道了1例使用高通量测序技术进行基因组检测帮助寻找耐药基因的耳念珠菌感染病例。该病例为1例81岁女性患者，因意识障碍和肢体瘫痪超过10个月被诊断为脑出血，接受了气管插管、留置胃管和导尿管。患者住院期间出现发热，经广谱抗菌药物治疗后效果不明显，尿培养发现耳念珠菌感染。该病例先后使用氟康唑和伏立康唑治疗均无效，改用伊曲康唑后体温降至36.4℃，但尿培养仍为阳性。对尿样本进行培养，经鉴定确认生长菌落为耳念珠菌。该标本的全基因组测序显示，其组装基因组大小为13 Mb，基因组SNP和INDEL(插入缺失)共有3 314个，在ERG11-Y132F、CDR1-E709D处存在氨基酸位点变异，TAC1b-Q503E和TAC1b-A583S处存在转录因子位点变异，其他位点未发现可疑突变。ERG11是报道的药物耐药基因中最常见的发生错义突变的基因，Y132F氨基酸替换是三唑类药物耐药的常见机制^{[25, 68]}。CDR1属于外排泵转运基因，耳念珠菌中的CDR1过表达会导致对三唑类药物耐药；而当CDR1基因缺失时，伊曲康唑和氟康唑的MIC值可以降低至1/64~1/128^[69]。TAC1B是一个锌家族转录因子，已被证明在大量氟康唑耐药菌株的编码基因中发生了变化^[69]。同时，引入包括TAC1B在内的氟康唑耐药基因到氟康唑敏感菌株中，氟康唑的MIC值翻倍，表明TAC1B突变影响了氟康唑的耐药性。

CDR1-E709D和TAC1B-Q503E是此分离标本中独特的突变位点，与其他地方描述的耐药基因位点不同，属于新发现的突变位点。目前，耳念珠菌在医疗机构中缺乏更有效的治疗选择和标准化的防控流程。在临床诊疗过程中，基因组学技术的应用有望快速检测耳念珠菌的分型和耐药基因的突变，协助个体化诊疗方案的制定。

4.   小结

自耳念珠菌被发现以来，研究学者已经研究了其流行病学、基因组演化、耐药机制、毒力和致病性。由于其高度的遗传变异性，耳念珠菌的诊断、治疗和研究均存在一定的困难，基因组学技术的应用为耳念珠菌的研究提供了更多手段。基因组学技术的应用帮助人们了解耳念珠菌的基因组，然后根据不同的基因组特征对耳念珠菌的类群进行划分，将不同类群的分离株特征与基因组差异关联，从而为后续耳念珠菌流行病学和耐药机制研究奠定了基础。此外，人们可以应用基因组学技术监测耳念珠菌的演化，并对新类群的出现做好准备。

目前，可以通过传统的体液、血培养等来诊断耳念珠菌感染；但其准确性依赖于试验人员能否从初级培养板精确挑选出耳念珠菌的菌落，存在误检和漏检的可能；而基因组测序方法在耳念珠菌的鉴定中则更加可靠^[70]。在临床诊疗中，基因组测序还能够发现耳念珠菌的分型和耐药性相关的基因信息，协助制定诊疗方案。

耳念珠菌在全球持续传播，感染率在中国呈现快速上升趋势，这对公共卫生构成了严峻挑战。为有效应对耳念珠菌的传播，必须在监测、防控和诊疗三个关键领域采取措施，而基因组学技术则在此过程中发挥了至关重要的作用。基因组学技术以其高准确度和快速响应的特性，成为诊断耳念珠菌感染的主要手段。与传统的培养筛查相比，基于聚合酶链反应(PCR)的监测筛查能显著缩短检测时间，这不仅减少了患者的隔离时间，也减轻了对个人防护用品的需求。考虑到消毒剂可能产生的耐药性，需要特别注意环境的清洁和消毒，临床应选择合适的消毒剂和确保足够的接触时间，对于有效防止耳念珠菌的传播至关重要。

基因组学技术在这一过程中发挥着重要作用，通过基因组测序可以鉴定出耳念珠菌的耐药基因，从而协助临床选择更加有效的消毒剂。此外，预防性使用抗真菌药物不是减少耳念珠菌感染的有效策略，反而可能由于选择性压力增加耳念珠菌的感染率和耐药性。基因组学技术在此环节能够精确鉴定耳念珠菌及其耐药基因，这有助于抗真菌药物的选择。结合培养及药敏结果，临床可以制定更加精准的治疗策略，从而提高治疗效果并降低耳念珠菌的传播风险。这些措施可以构成一个综合的策略框架，旨在有效控制并最终降低耳念珠菌感染的发生和传播。