Research progress on extracellular vesicles of Mycobacterium tuberculosis
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摘要: 结核病仍然是一个严重威胁全球公共卫生的问题，每年造成数百万人感染。结核分枝杆菌(MTB)是引起结核病的主要病原菌。近年来，MTB细胞外囊泡(MEVs)作为MTB分泌分枝杆菌抗原的重要载体已引起研究者关注。MEVs能够使MTB以集中保护的方式分泌磷脂、核酸、脂多糖和周质成分，并与宿主相互作用。对MEVs部分内容物的研究已取得了一些进展，但对其在宿主感染MTB过程中的生物发生机制、功能以及对机体免疫应答作用的认识仍处于初级阶段。本文综述目前MEVs生物发生机制的进展，在宿主感染MTB过程中，以及在调节免疫应答中的作用，并讨论其在疫苗开发和诊断技术方面的应用。Abstract: Tuberculosis (TB)is still a serious threat to global public health, causing millions of people infected every year. Mycobacterium tuberculosis (MTB) is the main pathogen causing TB. In recent years, MTB extracellular vesicles (MEVs) as important carriers for MTB-secreted Mycobacterium antigens have attracted the attention of researchers. MEVs enable MTB to secrete phospholipid, nucleic acid, lipopolysaccharide, and periplasmic component in a centralized protective mode, and interact with the host. Some progress has been made on the study of partial contents of MEVs, but the understanding of their biological mechanisms, functions, and roles in the immune responses during MTB infection is still at its early stages. This article reviews the current progress in the biogenesis of MEVs, their roles in MTB infection and immune responses regulation, and discusses their applications in vaccine development and diagnostic techniques.
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结核病(tuberculosis, TB)仍然是严重威胁全球公共卫生的流行病之一。世界卫生组织(WHO)2021年报道，TB是目前仅次于新型冠状病毒感染(COVID-19)全球第二大传染性疾病死亡的原因[1]。TB是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis, MTB)通过空气传播引起。TB自古以来就是人类致命的疾病，如今虽然已有诊断、监测方法以及治疗手段，甚至疫苗，但其一直对公众健康造成威胁，甚至导致发病和死亡[1]。WHO在《2022年全球结核病报告》[2]中指出，COVID-19大流行对TB的诊断、治疗以及TB的负担产生了破坏性影响，全球TB死亡人数从2019年的140万例升高至2020年的150万例，进而增加到2021年的160万例。
起源于内吞途径的微小囊泡几乎由人体所有细胞分泌，微小囊泡不仅具有许多母细胞的显著特征，同时具有自身独特的特征，含有蛋白质、脂质、核酸和代谢产物等生物活性大分子[3]。分枝杆菌与其他细菌、古细菌和真核细胞一样，自然释放细胞外囊泡(EVs)，与周围环境相互作用[4]。MTB细胞外囊泡(MEVs)大小不一，直径为60~300 nm，与革兰阴性菌产生的EVs大小相似[5]。除含有分枝杆菌质膜特征的脂质和脂蛋白外，还含有磷脂、核酸、脂多糖和周质成分。MEVs参与细胞毒性、微生物入侵、生物膜形成、膜融合和重要物质转运等，并能使其包含的MTB毒力因子运输到宿主细胞其他区域或进入细胞外环境，从而干扰邻近未感染细胞。在面临MTB广泛耐药，缺乏治疗药物的情况下，MEVs的发现无疑是一种机遇，MEVs可以用于TB的诊断，鉴别耐药株与非耐药株，从而提供更好的治疗方案，尤其是在面对人类免疫缺陷病毒(HIV)与MTB双重感染的患者时。此外，MEVs作为传递具有免疫活性的分枝杆菌毒力因子的途径之一，可在无佐剂的情况下诱导免疫应答，用于疫苗的研制[6]
1. MEVs
MEVs是革兰阴性菌特异EVs的一个子集，一直是倍受关注的研究领域。早在2007年就有研究[7]报道溃疡分枝杆菌生物被膜的形成及其在传播中的作用，采用扫描电子显微镜观察发现，囊泡嵌在溃疡分枝杆菌生物膜的细胞外基质中，并能够从感染MTB且已病变的小鼠尾部组织活检中观察到，且该研究还发现从细胞外基质中提取纯化的囊泡具有较高的细胞毒性。之后有研究人员发现包括牛分枝杆菌、减毒疫苗株和强毒株MTB均存在EVs，EVs通过运输脂质和蛋白质参与破坏宿主免疫反应，并引起炎症反应，能够促进MTB感染的毒性和TB进展[8]。2019年研究[9]发现，鸟结核分枝杆菌亚种和致病性副结核分枝杆菌等非结核分枝杆菌也能够产生EVs。至此之后，对MEVs的研究进一步深入。
2. MEVs的生物发生与组成
对MTB和牛型结核分枝杆菌进行研究[7]发现，MEVs起源于细胞膜。不同细菌之间的EVs生物发生机制不同，参与囊泡释放的因子也有所不同。MEVs的生物发生是一个由铁等金属营养素、利福平、VirR、磷酸盐特异性转运(Pst)系统、SenX3-RegX3系统、动力样蛋白(DLPs)、IniA等调节的过程。
遗传因素在一定程度上影响MEVs的产生。其中，VirR是一种与内膜相关的胞质蛋白，被称为囊泡生成和免疫反应调节剂，能够调控EVs的产生[10]。MEVs生物发生机制与MTB的一个转座子突变有关，即rv0431(VirR)过表达促使表面囊泡产生增加[11]。另一个似乎参与MEVs生物发生的基因是rv3371，其在耻垢分枝杆菌中的表达增加甘油三酯的水平，使干燥粗糙的表面变得光滑湿润，增加表面芽状结构的存在，有利于EVs的产生[12]。
此外，与富含铁的环境相比，在铁限制条件下，MEVs更多。Prados-Rosales等[13]研究发现，当MTB在缺铁条件下培养时，能够检测到囊泡产生增加，并且发现囊泡内含有的分枝杆菌素与细胞膜相互作用可以直接或间接地刺激囊泡的生成。不仅如此，可用性铁的降低也可能是其他细菌产生EVs的诱发因素。如大肠埃希菌和布鲁氏菌均在对数期结束时最大量的产生囊泡，可能与此时间段培养基中可用铁的减少相关。但是分泌的这些囊泡还需进一步观察，并进行包括囊泡定量和纳米颗粒跟踪分析等表征系统分析。
另一种参与MEVs生物发生的机制与Pst系统有关。研究[14]证明，ΔpstA1突变体以Regx3依赖的方式高分泌包含脂蛋白LpqH和PstS1的MEVs。Pst系统是一种高亲和力的ABC型转运系统，通过与SenX3-RegX3双组分信号转导系统相互作用而引起ESX-5蛋白分泌增加，编码Pst系统跨膜组件pstA1的缺失能够激活SenX3-RegX3[14]。SenX3-RegX3系统由膜结合传感器组氨酸激酶(SenX3) 和DNA结合反应调控因子(RegX3)组成[15]。RegX3调控ESX-5基因转录，PPE41和EsxN是MEVs分泌相关ESX-5的两种底物，而ΔpstA1突变体则依赖于ESX-5转录的增加及PPE41、EsxN的高度分泌[14-15]。即编码Pst系统跨膜组件的ΔpstA1突变体通过激活SenX3-RegX3系统，使得RegX3调控ESX-5基因转录，引起ESX-5蛋白分泌增加，从而导致PPE41和EsxN的高度分泌，进而使得包含脂蛋白LpqH和PstS1的MEVs分泌增加。此外，Pst/SenX3-RegX3系统可以不依赖ESX-5的活性来调控EVs产生[16]。VirR是MEVs产生的调控因子，但与野生型菌株VirR表达相比，ΔpstA1突变体菌株VirR表达的变化不大，两者比较差异无统计学意义[11]。此外，在ΔpstA1存在下，剔除VirR会导致MEVs产生率增高；而过表达VirR也能够导致MEVs的产量略有增加，这表明驱动MEVs产生的机制是协同的[16]。
DLPs也参与MEVs的生物发生机制[17]。DLPs是鸟苷三磷酸水解酶，介导原核生物和真核生物的膜重塑。研究[18]显示，一种可溶性DLPs，可使膜变形，促进膜裂变、膜重塑、质膜完整性的维持，并显著促进耻垢分枝杆菌对异烟肼(INH)的耐药性。在MTB中细菌DLPs IniA、IniC的失活导致囊泡的产生减少。IniBAC操纵子能够在缺铁和缺VirR的分枝杆菌中被诱导，此至少在一定程度上表明，铁和VirR通过控制IniBAC的表达调节MEVs的产生[19]。与野生型MTB相比，IniA的缺失会导致囊泡的减少，而这种影响不能单独被IniA或IniC所消除，但可以被带有整个野生型MTB的IniBAC操纵子质粒所消除，研究[19]还表明抗结核药物INH，其亚抑制浓度可诱导IniBAC促进MEVs的释放。
这些研究证实了细胞胞膜改变和MEVs释放之间的联系，证明了影响MEVs释放的几个因素趋同，并提供了一种潜在的机制，靶向DLPs介导的囊泡生成可能会有效地抑制对MTB的免疫调节能力，减弱对MTB感染的控制。
3. MEVs的功能
3.1 营养物质获取
MEVs在营养物质的获取中发挥重要作用，尤其是在铁摄取中。铁是细胞生长代谢所必需的。在铁限制的培养基中，MTB分泌MEVs，分枝杆菌素是一种有效的铁载体。在低铁条件下分泌的MEVs可以挽救无法产生像分枝杆菌素这样铁载体的MTB突变体，此外这些MEVs还可以依赖分枝杆菌素传递铁给野生型MTB，为其提供铁营养[13]。如在肉芽肿中严重缺铁的情况下，MEVs介导的铁捕获对感染期间MTB生存至关重要[20]。HupB是一种与MTB铁获取相关的多功能分枝杆菌蛋白，其在铁限制的条件下上调，作为分枝杆菌素生物合成的转录激活因子，是病原体在巨噬细胞内生存所必需的[21]。这进一步证实了MEVs参与MTB营养获取中的不可或缺作用。
3.2 致病机制
MEVs除了含有质膜特征的脂质和脂蛋白外，还含有包括磷脂、核酸、脂多糖和许多胞外成分[22]。分枝杆菌产生的囊泡通常从母体细菌运输到宿主远端，实现细菌间的交流和毒力效应因子的转移。蛋白质组学和生物化学研究[8, 22-24]显示，MEVs包含许多专属分子，包括脂蛋白(LpqH，LprG)、脂聚糖和糖脂[脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、脂聚糖(LM)和磷脂酰肌醇甘露糖苷(PIM)]和抗原(AG85B)等，而LpqH、LprG、LprA、PhoS1和LAM等免疫活性脂蛋白、脂聚糖和糖脂被认为是TLR-2的配体和激动剂。MEVs是MTB细胞内输出免疫活性脂质和脂蛋白的主要途径。TLR识别病原体相关的分子模式(PAMPs)，并启动信号转导途径，调节细胞因子、趋化因子和Ⅰ型干拢素(IFN)的表达，以实现先天和适应性免疫激活[25]。MEVs可激活TLR-2并诱导未感染的巨噬细胞产生细胞因子，并被证明能延长TLR-2信号转导, 但研究[26]显示，TLR-2激活延长会导致免疫抑制，导致白细胞介素-10(IL-10) 等免疫抑制细胞因子的产生，并最终抑制MHC-Ⅱ向CD4+ T细胞的提呈。给小鼠注射MEVs能诱导TLR-2依赖性的促炎反应[8]。脂多糖如LAM和LA等从MEVs内释放到细胞外环境，也为脂多糖到达和抑制T细胞提供了一种机制，可能促进免疫逃避[27]。
3.3 免疫调节
MTB产生的EVs参与细胞间通讯、免疫调节、毒力和细胞存活等多种活动。虽然MEVs近几年才被发现，但相关研究已经表明MEVs在宿主病原体相互作用中发挥重要作用。(1)免疫激活作用：MTB感染的细胞(主要是巨噬细胞、树突状细胞和中性粒细胞)释放含有MTB成分的囊泡，可通过促进或抑制免疫细胞的招募调节免疫反应。致病性副结核分枝杆菌感染的巨噬细胞源性EVs携带分枝杆菌蛋白ESAT-6、Mpt63、SodA、Mpt51和Ag85，作用于naïve巨噬细胞时，会增加细胞的吞噬率，增强如CD40、CD80、CD81、CD86、HLA-DR和CD195等信号分子的表达，以及促炎细胞因子的分泌[28]。Bhatnagar等[29]将卡介苗或MTB感染的巨噬细胞源性EVs注射入小鼠鼻内，发现可以诱导促炎细胞因子的产生，还可招募中性粒细胞和巨噬细胞到肺部，起到免疫监视作用。此外，来自MTB感染的巨噬细胞EVs也被证明可以激活内皮细胞，导致细胞释放更多的趋化因子受体和细胞黏附分子[30]。研究者用来自MTB感染的中性粒细胞EVs作用于MTB感染的巨噬细胞会增加巨噬细胞中超氧阴离子的产生和自噬，从而增加对细菌的清除能力[31]。此外，研究[32]发现，感染MTB的中性粒细胞释放的EVs作用于未成熟单核细胞来源的树突状细胞，增加共刺激分子CD80和共抑制分子PD-L1的表达，用其处理未成熟和成熟的树突状细胞均能够诱导自体MTB抗原特异性CD4+ T细胞产生干扰素-γ(IFN-γ)，表明这些EVs充当抗原载体并将分枝杆菌蛋白转移到抗原呈递细胞。此外，用卡介苗感染的巨噬细胞EVs治疗的小鼠，在小鼠的脾、肺和纵隔淋巴结均产生CD4+和CD8+ T细胞[33]。Smith等[34]研究通过利用小鼠Rab27a缺陷，在其感染MTB后通过外泌体转运的分枝杆菌抗原减少，肺和脾T细胞的活化降低，这种有限的免疫反应与细菌负荷量增加有关，表明T细胞反应增强与MTB感染期间释放的外泌体具有相关性[34]。来自MTB感染细胞产生的EVs在体内外进一步激活先天免疫反应与适应性免疫反应，发挥免疫调节作用。(2)免疫抑制作用：MTB感染细胞产生的EVs除了免疫激活作用外，免疫抑制作用也有被报道。MTB感染的巨噬细胞EVs，以依赖TLR-2的方式抑制MHC-Ⅱ和CD64的表达，从而部分抑制IFN-γ介导的巨噬细胞激活[35]。此外，来自MTB感染的巨噬细胞EVs也会抑制T细胞激活，导致白细胞介素-2(IL-2)的产生和T细胞增殖均减少，其作用与LAM单独作用时相似但其作用更强[27]。有关EVs的分离、纯化和表征早有报道，但关于其发生机制，是否携带更多的分枝杆菌成分输出细胞从而感染邻近细胞，以造成MTB的免疫逃逸等仍有待解决。
4. MEVs的应用
4.1 疫苗设计
MTB感染宿主细胞释放的EVs，体积小，在大部分体液中分布，含有MTB相关蛋白和核酸，能被免疫细胞吸收，具有天然免疫原性，并且能够作为传递具有免疫活性的分枝杆菌毒力因子的工具，可在无佐剂的情况下诱导免疫应答，这使MEVs成为设计新型无细胞疫苗的良好选择[6, 36]。如前所述，MEVs通过多种途径调控先天和适应性免疫反应抗MTB。携带分枝杆菌抗原的EVs可以显著保护小鼠免受MTB感染，这表明EVs有可能成为一种针对MTB感染的新型无细胞疫苗[37]。MTB感染的细胞EVs可以传递分枝杆菌抗原，调节先天免疫与适应性免疫应答。利用MTB感染抗原提呈细胞来源的EVs作为疫苗，不仅可以实现抗原提呈，还可以增强抗结核免疫的共刺激分子表达。2014年Prados-Rosales等[36]在MTB感染小鼠的模型中全身注射MEVs，结果显示与标准卡介苗接种相比，全身注射MEVs可以适度控制肺和脾脏中细菌复制，为小鼠提供保护。另外，一种针对奈瑟菌EVs研发的疫苗已经获得批准[38]。然而，为证明其具有保护作用，还需要进一步的研究确定EVs成分的特征，以及更多的体内外试验研究。
4.2 作为MTB感染的生物标志物
痰培养仍然是诊断TB的金标准，另外还有分子诊断检测MTB特异性核酸。痰培养中，不能获取痰标本成为了该方法最大的阻碍。因此，寻找新的诊断方法与标志物显得更为重要。分枝杆菌感染的细胞能够产生含有分枝杆菌成分的EVs，并在细胞培养物或体液中释放这些EVs。蛋白质组学和生物化学研究显示，MEVs包含许多专属分子，包括蛋白和核酸等，这些专属分子可能成为疾病的生物标志物，但还有待进一步研究。一项对痰涂片阳性和阴性的非HIV感染者、结核病患者和接种卡介苗的潜伏感染和非潜伏感染患者血清的研究，被用来调查MTB和卡介苗EVs作为生物标记物的潜力，以区分疾病状态，研究者检测了三个MEVs相关的抗原，以区分TB和非TB患者的血清[39]，这将鼓励更多研究者对MEVs作为诊断工具的进一步研究。Carranza等[40]从26例耐药结核病(DR-TB)患者和16例健康人血清中分离到EVs，在治疗期间的不同时间点，对未治疗和治疗患者的混合外泌体中miRNAs的差异表达进行了评估和单独验证，结果显示在耐多药TB患者中，miR-let7E-3P的表达下调，而miR-223-3P的表达增加。miR-let-7E-5P在任何MTB株引起的TB活动期均被抑制，而在MTB感染潜伏期或耐多药TB患者药物治疗一年后其表达增加，提示其可能作为肺结核的生物标志物[40]。另外，进行MEVs的非编码RNA(ncRNA)分析，确定了miRNA-185-5p是TB的新型生物标志物[41]。
5. 结语与展望
MTB在体内体外均产生EVs，这些EVs起源于细胞膜，含有分枝杆菌质膜特征的脂质和脂蛋白，还含有磷脂、核酸、脂多糖和周质成分，参与免疫应答调节，影响MTB生存。其产生是由铁等营养成分、药物、突变基因和Pst系统以及DLPs单独或共同调节的。MEVs能够通过TLR-2依赖的方式与外界相互作用，诱导产生细胞因子等，引起促炎反应，调节分枝杆菌的生存。另外，可通过促进或抑制免疫细胞的招募，从而激活或抑制先天免疫反应与适应性免疫反应，使感染MTB的宿主进入杀菌状态或者引起MTB免疫逃逸。这些研究表明，MEVs可以用于疫苗的研发，提供新的药物靶点，对潜伏性TB和TB进行诊断，并且有助于MTB耐药与非耐药菌株的鉴别。尽管对MEVs的研究愈来愈多，但其生物发生机制以及这些过程是如何调控的仍知之甚少。MEVs如何对机体免疫应答进行调控，以及具体的调控作用与机制都还需更深入的研究。
利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。
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