肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae, Kp)在我国临床分离率很高，可引起呼吸道感染、尿路感染、肝脓肿、血流感染、脑膜炎、胸腔感染、腹腔感染、皮肤伤口感染等，严重者可危及生命，是导致医院感染最常见的一种致病菌^[1-2]。20世纪80年代中期在我国台湾地区首次分离出高黏液肺炎克雷伯菌(hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae, hmKp)，与经典肺炎克雷伯菌(classical Klebsiella pneumoniae, cKp)相比，hmKp在菌落外观上一般表现出高黏液性，临床上通常将具有高黏液表型的Kp判定为高毒力肺炎克雷伯菌(hypervirulent Klebsiella pneumoniae, hvKp)^[3]。研究^[4]发现，不是所有的hvKp菌株都表现为高黏性特征，也并非所有hmKp菌株都具有高毒力，hvKp的鉴定需要从菌株的表型、基因型, 以及临床致病能力等方面综合判断。

Kp的高黏液表型受黏液表型调节基因A(rmpA)、黏性相关基因(magA)、控制细菌荚膜多糖(CPS)合成基因等因子调控，毒力与铁载体、荚膜多糖、菌毛等多种毒力因子密切相关，对Kp的这些毒力因子进行研究有助于深入研究Kp的致病机制，对于正确认识Kp所致感染，降低Kp的危害具有重要意义^[5-6]。传统观点认为，cKp菌株的耐药性较强，hvKp菌株虽然表现为高毒力表型，但对除氨苄西林外的临床常用抗生素均表现为敏感^[7]。近年来，多重耐药hvKp菌株高流行暴发的趋势陆续被报道，2019年我国某院重症监护病房(ICU)出现了耐碳青霉烯类hvKp感染暴发，患者病死率为100%，96.6%的分离菌株对包括碳青霉烯类在内的多种抗生素具有耐药性^[8]。hvKp菌株的高毒力与耐药性的重叠将给临床治疗带来巨大挑战。本研究对2019—2023年淮安市临床分离的hmKp耐药性及基因组特征进行研究，分析其耐药与毒力相关性因子，以期为hmKp感染临床合理用药治疗及明确hvKp的生物标志物提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   主要仪器与试剂

血琼脂平板(广东环凯微生物科技有限公司)，革兰阴性菌鉴定板(法国梅里埃公司)，VITEK 2 Compact全自动细菌生化鉴定仪(法国梅里埃公司)，BD Phoenix M50全自动微生物鉴定药敏分析仪(美国BD公司)。

1.2   菌株来源与鉴定

Kp菌株来源于2019—2023年淮安市国家致病菌识别网哨点医院的临床标本。将收集的菌株划线分离于血琼脂平板，观察菌株纯度，使用VITEK 2 Compat全自动细菌生化鉴定仪进行鉴定复核。hmKp菌株判定标准：用接种环轻轻向上挑起血平板上的Kp单菌落，重复牵拉两次或两次以上，挑起的拉丝长度≥5 mm的菌株判定为hmKp菌株，并统计分析hmKp来源标本类型。

1.3   细菌全基因组测序

hmKp菌株送上海伯杰医疗科技股份有限公司进行全基因组二代测序，测序平台为Illumina NovaSeq，测序深度大于100×。下机数据使用fastp(v0.23.2)滤除低质量reads，然后使用SPAdes(v3.15.5)对过滤后的数据进行无参组装拼接。

1.4   基于全基因组测序的分子分型

将菌株全基因组序列上传至BacWGSTdb 2.0^[9]数据库进行多位点序列分型(ST)分析。以HS11286(CP003200)为参考基因组进行核心基因组多位点序列分型(cgMLST)分析，设定核心基因差异数≤30的菌株为相同克隆复合群，并绘制核心基因组多位点序列分型树(MSTree)。

1.5   耐药基因和毒力基因注释

利用CARD数据库(http://arpcard.mcmaster.ca)对菌株基因组进行耐药基因注释，利用VFDB数据库(http://www.mgc.ac.cn/VFs/) 对菌株基因组进行毒力基因注释，选取与相应数据库中已知基因覆盖度(coverage值)和同源性(identity值)均大于90%的基因进行统计。

1.6   药物敏感试验

采用微量肉汤稀释法检测菌株的耐药表型。根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)标准(2022)进行耐药折点判读。依据《多重耐药菌医院感染预防与控制技术指南(试行)》，对3类或3类以上抗菌药物具有耐药性的菌株判定为多重耐药菌株。对亚胺培南或美罗培南耐药的Kp菌株判定为耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKp)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、肺炎克雷伯菌ATCC 700603。

1.7   统计方法

应用SPSS软件对耐药数据进行卡方检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。对菌株耐药表型和耐药基因携带情况进行kappa一致性分析，kappa≤0.2表示一致性较差，0.2＜kappa≤0.4表示一致性一般，0.4＜kappa≤0.6表示一致性中等，0.6＜kappa≤0.8表示有较高的一致性，kappa＞0.8表示有很好的一致性。

2.   结果

2.1   hmKp鉴定结果

经生化鉴定和拉丝试验，共检出hmKp 60株。分离自10种临床标本，以痰(33.33%，20株)和血(28.33%，17株)标本为主，其次为支气管肺泡灌洗液(8.33%，5株)、引流液(6.67%，4株)、尿(6.67%，4株)、粪便(6.67%，4株)、咽拭子(5.00%，3株)标本，腹腔积液、穿刺液、分泌物各分离1株(各占1.67%)。

2.2   全基因组测序与ST结果

60株hmKp基因组经测序、过滤、拼接组装，基因组平均大小为5.6 (5.1~5.7)Mb，平均GC含量为57.09% (45.99%~57.82%)。60株hmKp共有26种已知ST型和2种新ST型。优势ST型为ST11(11.67%，7株)、ST15(11.67%，7株)和ST412(10.00%，6株)。见图 1。ST412菌株主要分离自痰标本。

图  1  60株hmKp ST型分布图

Fig.  1  Distribution of ST types of 60 hmKp strains

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利用BacWGSTdb 2.0数据库构建的MSTree见图 2。菌株分布分散，无聚集性菌株，相同ST型菌株间距离更近，按照核心基因组差异数≤30作为判断菌株之间具有高度同源性的标准，高度同源的菌株有ST11 3株，ST15、ST76、ST1各2株，结合这些菌株的临床背景信息，排除重复菌株和散在暴发菌株的可能性，表明这些菌株在本地区流行。

图  2  60株hmKp cgMLST最小生成树

注：圆圈内数字代表ST型，横线上数字代表菌株之间核心基因差异数。

Fig.  2  Minimum spanning tree for cgMLST of 60 hmKp strains

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2.3   耐药表型

60株hmKp对10类14种抗菌药物敏感性试验结果显示，21.67%(13株)的菌株对所有测试抗菌药物敏感，其余菌株至少对1种抗菌药物耐药或中介，多重耐药菌株占60.00%(36株)，最多对13种抗菌药物耐药。60株hmKp耐药表型热图见图 3。

图  3  60株hmKp耐药表型热图

注：CT为多黏菌素E，AZM为阿奇霉素，STR为链霉素，SXT为复方磺胺甲 唑，TET为四环素，CTZ为头孢他啶，AMI为阿米卡星，ETP为亚胺培南，MEM为美罗培南，CTX为头孢噻肟，AMS为氨苄西林/舒巴坦，NAL为萘啶酸，CHL为氯霉素，CIP为环丙沙星，R为耐药，I为中介，S为敏感。

Fig.  3  Heatmap of resistance phenotypes of 60 hmKp strains

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60株hmKp检出CRKp 17株，碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌(non-CRKp)43株。除复方磺胺甲 唑外，CRKp对其余11种抗菌药物的耐药率均高于non-CRKp，其中两者对氯霉素、头孢噻肟、头孢他啶、环丙沙星、萘啶酸、阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦的耐药率比较，差异均有统计学意义(均P＜0.001)，对复方磺胺甲 唑、多黏菌素E、四环素、阿奇霉素和链霉素的耐药率比较差异均无统计学意义(均P＞0.05)。总体上，60株hmKp对头孢噻肟、氯霉素、萘啶酸、四环素的耐药率≥40.00%，对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别为28.33%、23.33%，对多黏菌素E耐药率较低(5.00%)。见表 1。

2.4   耐药基因携带情况及注释

60株hmKp携带了编码抗性蛋白、外排泵、酶灭活，以及抗菌药物作用位点改变的四种耐药机制对14类抗菌药物耐药的64种耐药基因(覆盖度＞90%、同源率＞90%)。按照抗菌药物大类统计，磷霉素相关耐药基因和超广谱β-内酰胺类抗生素相关耐药基因在菌株中携带率较高，分别为100%(60株)、98.33%(59株)。碳青霉烯类耐药基因bla_KPC-2由ST11(7株)、ST1(2株)和ST15(4株)菌株携带，bla_NDM-5基因由ST76(2株)菌株携带。64种耐药基因中有54种位于可移动原件上，其中喹诺酮类、利福霉素类、大环内酯类、碳青霉烯类、产超广谱β-内酰胺类、二氨基嘧啶类、磺胺类抗菌药物耐药相关基因均位于可移动原件上。见表 2。

通过菌株基因组中耐药基因携带情况，预测其具有相应耐药表型的准确率在44.07%~100%，其中磺胺类药物的预测准确率最高，产β-内酰胺类药物的预测准确率最低。磺胺类、碳青霉烯类、四环素类抗菌药物药敏试验结果与菌株携带相关耐药基因情况一致性较高；喹诺酮类、氨基糖苷类、氯霉素类、大环内酯类抗菌药物药敏试验结果与菌株携带相应耐药基因情况一致性一般；β-内酰胺类药敏试验结果与菌株携带相应耐药基因情况一致性较差。部分菌株携带相关耐药基因但对测试的抗菌药物敏感，可能与本研究测试的抗菌药物种类较少有关，如β-内酰胺类抗生素种类较多，本研究中只选择了2种；部分菌株对抗菌药物耐药，但未检测到相应的耐药基因，可能与基因注释方法或存在新的耐药基因有关。见表 3。

2.5   毒力基因携带结果及注释

60株hmKp菌株基因组中存在与菌毛、外毒素、荚膜多糖、铁载体等致病因子相关的13类101种毒力基因，其中Colibactin和Ⅵ型分泌系统相关毒力基因种类最多，均有17个。所有菌株均携带荚膜合成调节相关基因(rcsA、rcsB)、外排泵相关基因(acrA、acrB)、肠杆菌素相关基因(entABCEF、fepABCDFG、fes)，Ⅰ型和Ⅲ型菌毛相关基因的携带率均＞95%。部分毒力基因与菌株ST型密切相关，如allA、allB、allC、allD、allR、allS均在ST23菌株中，tle1基因均由ST11菌株携带，Colibactin的17种毒力基因主要由ST23菌株携带，优势ST型菌株ST11、ST15、ST412均不携带Allantion utilization和Colibactin相关毒力基因。60株hmKp毒力基因携带情况见图 4。

图  4  60株hmKp毒力基因携带情况

Fig.  4  Carriage of hmKp virulence genes of 60 hmKp strains

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3.   讨论

研究^[10]表明，hmKp更易引起侵袭性感染，且不仅能够感染免疫功能低下者，还能在健康个体中出现危及生命的社区获得性感染。临床上hmKp检出率较高的标本包括痰、尿等，宁波地区重症感染患儿痰标本中hvKp检出率高达97.96%^[11]。本研究中，60株hmKp来源标本类型广泛，以痰和血标本为主，与刘淑敏等^[4]报道的结果相似。

60株hmKp ST型多样，提示本地区hmKp菌群结构分散，优势ST型为ST11、ST15和ST412，与以往研究^{[4, 12]}不同。除ST412型菌株(主要分离自痰标本)外，菌株ST型与其来源标本类型之间无明显相关。通过cgMLST方法进一步分析，60株菌株中有部分菌株高度同源，但未发现暴发菌株。通过比较进一步表明，cgMLST比MLST具有更高的分辨力，适合亲缘关系较近菌株间的分型。ST11型hvKp是目前亚洲地区流行的耐碳青霉烯类抗生素hvKp菌株的主要型别，携带pLVPK质粒；ST15型hvKp菌株也被报道携带含有多重耐药基因和毒力基因的融合质粒，两种ST型别菌株均可水平传播并导致致命感染^[13-14]，应引起足够重视，继续加强此类菌株的监测力度。

本研究中菌株对氯霉素类、甲氧苄啶类、碳青霉烯类、头孢菌素类、四环素类、喹诺酮类、氨基糖苷类抗菌药物的耐药率为23.33%~43.33%，其中复方磺胺甲 唑耐药率低于金美玲^[12]报道的北京某医院临床分离的hmKp菌株耐药率，环丙沙星、亚胺培南、头孢他啶、阿米卡星、美罗培南、亚胺培南的耐药率高于金美玲^[12]报道的hmKp菌株。研究^[15]结果表明，hmKp比非hmKp对大多数抗菌药物耐药率低，由于本研究中未涉及非hmKp菌株，对于本地hmKp与非hmKp耐药性的比较需进一步研究。值得临床高度关注的是本地区分离hmKp中，多重耐药菌株(占比60.00%)和耐碳青霉烯类抗生素的菌株占比(＞23%)较高，给临床治疗带来一定难度。本研究中碳青霉烯耐药菌株ST型为ST11、ST1、ST15和ST76，主要耐药机制为携带bla_KPC-2和bla_NDM-5基因，与相关研究^[16-17]报道结果相同。进一步分析耐药基因发现，菌株携带多种类型耐药基因，菌株耐药表型和其携带的耐药基因不完全一致，可能与基因注释的算法或存在新的耐药机制，以及选取的抗菌药物种类有关，但是全基因组测序及耐药基因注释在预测菌株耐药表型方面展示出较好的应用前景。需引起足够重视的是，84.38%的耐药基因位于可移动原件上，能够进行水平转移传播，从而造成多重耐药菌株的播散，应加强防控。

本研究中菌株携带的毒力基因种类较多，部分毒力基因与菌株ST型密切相关。位于质粒上、作为hvKp标志的iroB、iucA、rmpA和rmpA2基因携带率分别为43.33%、35.00%、51.67%、30.00%^[18]。rmpA、rmpA2、铁载体是导致hvKp菌株比cKp菌株毒力更强的关键因素，这几种毒力因子在本研究菌株中的携带率均较高，说明这些菌株具有较强的致病力。

综上所述，对该地区临床分离hmKp的耐药性，以及相关机制、毒力因子携带情况进行分析，为有效遏制hmKp传播和暴发流行提供了数据支撑。