近20年来，全球重大传染病和生物安全风险日益加剧，给国家安全和社会稳定构成重大挑战。消毒是快速响应疾病暴发并迅速从疫情及生物事故中恢复的重要手段。传统消毒主要依靠喷洒或熏蒸化学消毒剂，可有效杀灭空间和物体表面的各种病原微生物，但也存在化学残留、污染环境、危害人体健康等诸多问题^[1-2]。紫外消毒技术是一种能够杀灭病原微生物的有效手段，属于物理消毒，具有副产物低、无化学残留的优点。传统紫外汞灯可以产生连续杀菌紫外线，已广泛应用于空间和物体表面的日常消毒^[3-4]。紫外消毒效果直接由波长和照射剂量决定，但紫外汞灯也存在易产生臭氧、消毒周期长、人机共存难等不足，限制了紫外汞灯的应用^[5-6]。

紫外光和激光同属于电磁波。紫外激光是单一频率的高能光束，波长属于紫外波段(10~400 nm)，具有单色性好、能量高、准直性好的特点，与汞灯发出的连续紫外线相比具有更高的辐照度^[7]。由于晶体的非线性系数通常比线性介电常数小几个数量级，紫外激光通常以高峰值的脉冲形式输出，因此目前常用的紫外激光器输出光以脉冲紫外激光为主^[8]。随着近年来激光应用技术快速发展，利用激光生成特定波段的脉冲紫外线用于消毒成为可能。脉冲紫外激光可以实现对病原微生物的快速消杀^[9-12]。然而，多数研究主要集中于对微生物菌悬液的消毒^[12]，未见直接以物体表面消毒标准方法所规定的染菌玻片为消毒对象的试验研究，缺少针对实际应用场景的效能评估；同时，也未见紫外激光与相同波段的传统紫外汞灯在杀菌能力的对比研究。本研究以大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢为试验对象，开展波长为254 nm的连续紫外线和脉冲紫外激光消毒效果的对比研究。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   试验用紫外光源

(1) TUV 15 W/G15 T8无臭氧型消毒汞灯(飞利浦)，功率为15 W；(2)由课题组和河北工业大学先进激光技术研究中心联合研制的紫外激光消毒装置(见图 1)，由激光发生器和输出光纤组成，其单脉冲能量可调，波长可调，脉冲宽度为6 ns，重复频率为60 Hz。紫外汞灯与紫外激光的波段均为254 nm。

图  1  紫外激光消毒装置实物图

Fig.  1  UV laser disinfection apparatus

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1.1.2   紫外线测试仪器

(1) 紫外光谱辐照计(OHSP-350UVS，杭州虹谱光色科技有限公司)，辐照测量范围为0.1 μW/cm²~100 mW/cm²，波长误差为±0.3 nm，波长测量范围为200~450 nm；(2)Ocean Optics光谱仪(SR-4 UV240-10，蔚海光学仪器有限公司)，波长误差为±0.5 nm，波长测量范围为220~530 nm；(3)单通道UV-B型紫外辐照计(北京师大光电技术有限公司)，辐照度测量范围为0.1 μW/cm²~199.9 mW/cm²，相对示值误差在±8%以内，波长测量范围为230~275 nm，峰值波长为254 nm；(4)Ophir能量计(P/N 7Z01701，以色列Ophir公司)，能量测量范围为20 μJ~10 J，相对示值误差在±3%以内，波长测量范围为190~2 200 nm。

1.1.3   试验菌种

大肠埃希菌(Escherichia coli)8099和萎缩芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus，曾用名为枯草芽孢杆菌黑色变种)ATCC 9372，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，本研究以10 mm×10 mm玻片为载体进行染菌测试。

1.2   试验平台

试验环境：加强型生物安全二级实验室，采用全新风空调系统，换气次数＞15次/h，静态洁净度达到ISO 8级，温度为(22±1)℃，相对湿度为(30±5)%。操作平台为Ⅱ级A2型(HR1500-ⅡA2，海尔生物医疗科技有限公司)生物安全柜。试验过程中，实验室通风系统全程开启，即使汞灯产生微量臭氧，也可通过新风换气而被快速去除，从而降低因臭氧产生的消毒叠加影响。

消毒汞灯灯管悬挂固定于生物安全柜内工作区的顶部中间位置，灯管距工作台面垂直距离为360 mm，消毒时，染菌玻片置于灯管正下方。由于体积较大，紫外激光器放置在生物安全柜外，通过光纤将激光传导至输出终端，以探头形式使激光光束对病原微生物进行垂直照射消毒试验，激光探头距染菌玻片100 mm。见图 2、3。

图  2  紫外汞灯和紫外激光消毒示意图

注：A为紫外汞灯；B为紫外激光。

Fig.  2  Schematic of ultraviolet mercury lamp and UV laser disinfection

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图  3  紫外激光消毒试验

Fig.  3  UV laser disinfection test

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1.3   方法

1.3.1   紫外线辐射照度的测量

(1) 紫外消毒汞灯辐照强度测量：开启紫外灯20 min后，使用紫外辐照计在拟放置染菌玻片处测量254 nm波长紫外线辐射照度。(2)紫外激光消毒装置辐照能量测量：测量时，将孔径为1 cm×1 cm正方形(与染菌玻片尺寸一致)的不锈钢片置于能量计探头上，对1 cm×1 cm的区域进行辐照能量的测定。根据所测得的辐射照度和平均单脉冲能量，计算染菌玻片的辐照剂量，紫外汞灯计算公式为P=D×t，紫外激光的计算公式为P=E×f×t。其中，P为辐照剂量，单位为mJ/cm²；t为时间，单位为s；D为汞灯的辐射照度，单位为μW/cm²；E为激光单脉冲能量，单位为μJ/cm²；f为激光的重复频率，单位为Hz。

1.3.2   染菌载体的制备

参考《消毒技术规范》(2002年版)^[14]，选择大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢模式作为研究对象。其中，大肠埃希菌为直接购买的成品染菌载体玻片(A0210，中国工业微生物菌种保藏管理中心)，萎缩芽孢杆菌为芽孢悬液(A0020，中国工业微生物菌种保藏管理中心)制备而成的染菌载体玻片，尺寸均为10 mm×10 mm。萎缩芽孢杆菌染菌玻片由浓度为10⁸ CFU/mL芽孢悬液滴加于玻璃载体上制成，所用玻璃载体于染菌前均进行脱脂处理，经高压蒸汽灭菌后，使用滴染法进行染菌。在生物安全柜内，将经灭菌的玻璃载体片平铺于无菌平皿内，逐片滴加10 μL的芽孢菌液，用接种环均匀涂布整个玻片表面。将染菌玻片置于生物安全柜工作台面自然阴干后备用，每个菌片的回收菌量为5×10⁵~5×10⁶ CFU/片。

1.3.3   载体定量杀灭试验

试验前使用高压蒸汽灭菌器对试验工具121℃灭菌30 min，并对生物安全柜内的工作区采用紫外线照射30 min，避免环境微生物污染。取3个玻片作为试验组，同时设立阴性对照组和阳性对照组，阴性对照组为未染菌玻片，阳性对照组为未经紫外照射的染菌玻片。分别使用紫外汞灯和紫外激光消毒装置对试验组的染菌玻片进行照射消毒，达到照射时间后，将染菌玻片置于含无菌去离子水的试管中震荡洗脱。对大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢分别采用营养琼脂、胰酪大豆琼脂平板计数法，将消毒后逐级稀释的大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌菌液分别接种于营养琼脂培养基、胰酪大豆琼脂培养基中，经37℃培养48 h后测定对照组和试验组的菌落数，为提高试验结果的准确性，在相同的辐照剂量下，对每个样品重复测量3次，取平均值，最后以杀灭对数值判定消毒效果。

1.3.4   扫描电子显微镜(SEM)表征检测

使用Hitachi 8100型扫描电子显微镜(SEM)在电镜工作电压为5、10 KV，电子束流为10 μA，样品台工作距离8 mm的条件下，观察分析大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢染菌玻片的表面和菌层截面形貌。

2.   结果

2.1   紫外线辐射照度及光谱

紫外汞灯在拟放置染菌玻片处通过UV-B型紫外辐照计测得的辐射照度为136.40 μW/cm²，紫外激光消毒装置在染菌玻片处通过Ophir能量计测得激光平均辐射单脉冲能量为13.00 μJ/cm²，在5 min(大于试验组最长消毒时间)内能量持续输出维持不变，计算得出其平均辐射照度为780.00 μW/cm²。利用OHSP-350UVS紫外光谱辐照计测量汞灯光谱，波长峰值集中于254 nm，利用Ocean Optics光谱仪测量激光光谱，波长峰值集中于254.19 nm，基本不存在其他波段的杂光，见图 4。

图  4  连续紫外线和脉冲紫外激光光谱

Fig.  4  Spectra of continuous UV and pulsed UV laser

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2.2   紫外汞灯对大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢的消毒效果

使用紫外汞灯对大肠埃希菌染菌玻片照射106 s，辐照剂量为14.46 mJ/cm²，杀灭对数值为3.10，达到消毒水平；为进一步测试杀灭对数值阈值，将紫外汞灯的照射时间延长至30 min，辐照剂量为245.52 mJ/cm²，杀灭对数值为5.00，未达到灭菌水平。使用紫外汞灯对萎缩芽孢杆菌芽孢染菌玻片照射消毒83 s，辐照剂量为11.32 mJ/cm²，杀灭对数值为1.73；照射30 min，辐照剂量为245.52 mJ/cm²，杀灭对数值仅为2.92，仍然未到达消毒水平。见表 1。

2.3   紫外激光对大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢的消毒效果

使用紫外激光对大肠埃希菌染菌玻片照射20 s，辐照剂量为16.00 mJ/cm²，杀灭对数值为3.34，达到消毒水平；延长照射时间至267 s，辐照剂量为208.39 mJ/cm²，杀灭率高达100%，杀灭对数值为6.29，大肠埃希菌完全失活，达到灭菌水平。使用254 nm紫外激光对萎缩芽孢杆菌芽孢染菌玻片进行照射消毒，照射14 s，辐照剂量为11.27 mJ/cm²，杀灭对数值为1.32；照射161 s，辐照剂量为125.72 mJ/cm²，杀灭对数值为3.18，达到消毒水平。见表 2。

2.4   254 nm紫外线对大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢的剂量-杀灭对数值关系

为开展紫外激光与相同波段的连续紫外线传统紫外汞灯在杀菌能力的对比研究，将254 nm传统紫外汞灯和紫外激光对大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢染菌玻片的消毒效果绘制成剂量-杀灭对数值曲线。对大肠埃希菌的杀灭能力，汞灯产生的连续紫外线，其杀灭对数值达到3.10时所需的辐照剂量约为14.46 mJ/cm²，而紫外激光在辐照剂量为16.00 mJ/cm²时其杀灭对数值为3.34，两者在达到消毒水平所需的辐射剂量基本一致。随着照射时间延长，连续紫外线在辐照剂量为245.52 mJ/cm²下其杀灭对数值达到5.00，而紫外激光在辐射剂量为208.39 mJ/cm²时其杀灭对数值为6.29，两者杀灭能力产生了较大差异。同时，在大致相同的辐照剂量下，紫外激光对大肠埃希菌的杀灭效果优于紫外汞灯。见图 5。

图  5  254 nm紫外线对大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢染菌玻片的剂量-杀灭对数值曲线

Fig.  5  Dose-killing logarithmic curve of 254 nm UV radia-tion on Escherichia coli and Bacillus atrophaeus spore slides

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对萎缩芽孢杆菌芽孢的杀灭能力，紫外激光照射125.72 mJ/cm²剂量可使萎缩芽孢杆菌芽孢达到消毒水平，汞灯的杀灭对数值仅为2.57，即使将辐照剂量提高至245.52 mJ/cm²，仍未达到消毒水平。在低剂量(≤45 mJ/cm²)的紫外暴露下，汞灯对萎缩芽孢杆菌芽孢的消毒效果略好于紫外激光；进一步提升辐照剂量，紫外激光的消毒效果仍可明显提升，其杀灭对数值高于汞灯产生的连续紫外线。见图 5。

2.5   254 nm紫外线对大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢的平均对数杀灭剂量

为进一步分析，计算连续紫外线和紫外激光对两种微生物的平均对数杀灭剂量(杀灭对数值减少1的平均辐照剂量)。随着辐照剂量的增加，大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢的消杀效果逐渐提升，平均对数杀灭剂量达到最大值。根据表 1和表 2可知，紫外汞灯辐照剂量为245.52 mJ/cm²时，大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢的平均对数杀灭剂量分别为49.10、84.08 mJ/cm²；而紫外激光辐照剂量为208.39、206.80 mJ/cm²时，两种微生物的平均对数杀灭剂量分别为33.13、62.29 mJ/cm²。根据杀灭曲线选取4个区间的杀灭对数值，分别计算连续紫外线和紫外激光对两种微生物的平均对数杀灭剂量(杀灭对数值减少1的平均辐照剂量)。结果显示，(1)连续紫外线对大肠埃希菌的杀灭对数值达到3.00之后，其平均对数杀灭剂量快速增加；而紫外激光则是在杀灭对数值达到4.50之后，其平均对数杀灭剂量增加明显。(2)连续紫外线对萎缩芽孢杆菌芽孢的杀灭对数值达到2.40之后，其平均对数杀灭剂量快速增加；而紫外激光则是在杀灭对数值达到2.80之后，其平均对数杀灭剂量增加明显。(3)对大肠埃希菌的平均对数杀灭剂量方面，在杀灭对数值在3.00~4.45的范围内，紫外激光所需的辐照剂量约是连续紫外线的1/2；对萎缩芽孢杆菌芽孢的平均对数杀灭剂量方面，在杀灭对数值在1.60~2.39的范围内，紫外激光所需的辐照剂量与连续紫外线大致持平，而在杀灭对数值在2.40~2.79的范围内，紫外激光所需的辐照剂量大约是连续紫外线的1/3。见图 6。

图  6  254 nm紫外线消毒大肠埃希菌、萎缩芽孢杆菌芽孢的平均对数杀灭剂量

注：A为大肠埃希菌，B为萎缩芽孢杆菌芽孢。

Fig.  6  Mean logarithmic killing dose of Escherichia coli and Bacillus atrophaeus spore after disinfection with 254 nm UV

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2.6   SEM表征检测结果

观察病原微生物的微观结构和消毒前后的变化，使用SEM拍摄大肠埃希菌和萎缩芽孢杆菌芽孢染菌玻片在汞灯照射下消毒前后的微观形貌。结果显示，微生物个体被包裹在已脱水的磷酸盐板块中或是多层堆叠在玻片表面。消毒前的微生物个体圆滑饱满，结构完整，见图 7A、C；消毒后的微生物个体普遍出现不同程度的萎缩和破碎，见图 7B、D。

图  7  紫外线对大肠埃希菌、萎缩芽孢杆菌芽孢消毒前后不同放大比例的SEM图

注：A为大肠埃希菌消毒前，B为大肠埃希菌消毒后，C为萎缩芽孢杆菌芽孢消毒前，D为萎缩芽孢杆菌芽孢消毒后。

Fig.  7  SEM images of Escherichia coli and Bacillus atrophaeus spore before and after disinfection with UV at different magnifications

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3.   讨论

本研究结果显示，随着辐照剂量的增加，连续紫外线和紫外激光对大肠埃希菌、萎缩芽孢杆菌芽孢染菌玻片的杀灭对数值总体均呈现先快速上升后逐渐平缓的趋势。大肠埃希菌的平均对数杀灭剂量在杀灭对数值分别达到3.0、4.5后迅速增加，而萎缩芽孢杆菌芽孢则是在分别达到2.4、2.8后明显增加，表明杀灭对数值达到一定值后，消杀过程进入相对稳定的阶段，消杀难度显著提高。基于SEM表征分析，在对染菌玻片进行照射消毒时，紫外线可以快速地对表层及浅表的微生物完成杀灭，而附着于玻片底部的菌层则因紫外线难以有效穿透菌层的整体厚度导致杀灭难度增加。结合平均对数杀灭剂量和SEM表征结果分析，解释了杀灭对数值前期增长快后期明显放缓的原因，说明在不增加辐射照度情况下，即使大幅增加辐射剂量其杀灭对数值增长仍缓慢。在紫外线辐射照度对比方面，本次试验所用紫外激光的单脉冲能量为13 μJ/cm²，但由于其脉冲时间短，经过换算，其在6×10^-9 s的极短时间内辐射照度可达2 167 W/cm²，接近汞灯的1 600万倍，意味着相较紫外汞灯其具有更高的穿透性。这可能是紫外激光比汞灯展现出更强的杀菌能力的关键原因之一。紫外汞灯主要依靠光化作用灭活病原微生物，而紫外激光则是结合光化、光热两种方式共同作用，从而使杀灭效率更高^[12]。

对大肠埃希菌的杀灭能力，汞灯产生的连续紫外线，其杀灭对数值达到3.10时所需的辐照剂量为14.46 mJ/cm²，而紫外激光在辐照剂量为16.00 mJ/cm²时其杀灭对数值为3.34，两者在达到消毒水平所需的辐射剂量接近《消毒技术规范》(2002版)^[13]给出的紫外线对杀灭一般细菌繁殖体所需的10 000 μW·s/cm²(10 mJ/cm²)推荐剂量。对萎缩芽孢杆菌芽孢的杀灭能力，在紫外激光照射125.72 mJ/cm²的剂量下，萎缩芽孢杆菌芽孢达到消毒水平，这一剂量接近《消毒技术规范》(2002版)^[13]中推荐的100 000 μW·s/cm²(100 mJ/cm²)用于杀灭细菌芽孢的剂量。

综上所述，相较传统汞灯生成的连续紫外线，脉冲紫外激光消毒具有明显优势。但若使紫外激光成为一种实用的消毒手段，仍存在一系列问题：(1)紫外激光的脉宽、单脉冲能量、频率等各参数灭活权重尚不明晰；(2)受限于激光生成技术其消毒杀灭研究主要集中于266 nm^{[7, 9, 11, 14]}，其他紫外波段消毒杀灭能力未知；(3)缺少紫外激光材料兼容性、环境适应性等方面研究。同时，本研究尚存在一定局限性：(1)尚未针对紫外激光的消毒机制开展深入研究，如紫外激光光热反应效能、核酸和蛋白的损伤机制等；(2)研究主要采用了物体表面消毒效果评价常用的菌种，尚未对真菌、病毒等微生物开展研究。后续研究将进一步围绕以上问题展开，为紫外激光消毒的实际应用提供理论和数据支撑。